طريقة بسيطة للتصوير Arabidopsis يغادر طريق Perfluorodecalin كوسيط التصوير إختراقي
Summary
نحن تصف استخدام perfluorodecalin كوسيط الارتشاحي المتزايدة. هذه هي طريقة بسيطة لتحسين عمق في التصوير<em> thaliana Arabidopsis</em> أنسجة نبات مع الحد الأدنى من التأثير الفيزيولوجي.
Abstract
ومن المعترف به على نطاق واسع لمشكلة الحصول على صور عالية الدقة في عمق العينات البيولوجية 1. في الهواء مملوءة الأنسجة مثل mesophyll الاسفنجية من أوراق النبات أو الرئتين الفقاريات المزيد من الصعوبات الناجمة عن التحولات المتعددة في معامل الانكسار بين المكونات الخلوية ، وبين الخلايا وأجوائها ، وبين الأنسجة البيولوجية وبقية النظام البصري. علاوة على ذلك ، عدم التطابق معامل الانكسار يؤدي إلى توهين من الإثارة وانبعاث fluorophore في إشارة المجهري مضان. نحن هنا وصف تطبيق المشبعة ، perfluorodecalin (PFD) ، كوسيط التصوير الارتشاحي مما يحسن الليزر بصريا المسح المجهري متحد البؤر (LSCM) على عمق التصوير عينة ، من دون اللجوء الى الزيادات الضارة في قوة الليزر ، والحد الأدنى من التأثير الفيزيولوجي 2. نحن تصف البروتوكول لاستخدام PFD مع Arabidopsis thaliana الأنسجة ورقة ، وهو مجمع بصريا نتيجة لهاهيكل (الشكل 1). PFD لديها عدد من السمات التي تجعلها مناسبة لهذا الاستخدام 3. معامل انكسار PFD (1.313) هو مقارنة مع تلك المياه (1.333) ، وأقرب إلى العصارة الخلوية (حوالي 1.4) من الهواء (1،000). بالإضافة إلى ذلك ، PFD في متناول الجميع ، غير الفلورسنت وغير سامة. التوتر السطحي انخفاض PFD (19 سم dynes -1) هو أقل من المياه (72 سم dynes -1) ، وأيضا أقل من الحد (25 — 30 سم داين -1) لاختراق فوهي 4 ، مما يسمح لها الفيضانات وأجوائها mesophyll إسفنجي دون تطبيق فراغ يمكن أن تكون مدمرة أو السطحي. أخيرا والأهم من ذلك PFD لديه قدرة كبيرة على تذويب CO 2 و O 2 ، والذي يسمح بالإبقاء تبادل الغاز في الأنسجة غمرت المياه ، مما يقلل من تأثير على العينة الفسيولوجية. وقد استخدمت هذه الخصائص في مختلف التطبيقات التي تشمل التنفس السائل جزئية وinfla الرئة5،6 نشوئها ، والجراحة 7 ، 8 الدم الاصطناعي ، الأوكسجين في نمو وسائل الاعلام 9 ، ودراسات لتكوين بلورات الجليد في النباتات 10. حاليا ، فمن الشائع أن يشن في الماء أو الأنسجة العازلة للتصوير المائي مبائر حية. نحن نعتبر أن استخدام PFD كوسيلة متزايدة يمثل تحسنا في الممارسة الحالية وتسمح للتحضير عينات بسيطة من العيش ورقة كاملة للتصوير.
Protocol
Discussion
هذا هو أسلوب بسيط وسهل الاستخدام لتحسين الفحص المجهري للهواء أو معقدة مليئة بصريا الأنسجة. لقد أظهرنا أن لديه بعض مزايا تقنية قوية ، ونحن نأمل أن يتم استخدامها لتوضيح المسائل المتعلقة البيولوجية في الهواء الغنية الأنسجة. على سبيل المثال فإنه سيكون خيارا طبيعيا للدراسات من مهاجمة مسببات الأمراض النباتية في mesophyll أو في الرئتين. ونحن أيضا على بينة من القيود المفروضة على هذه التقنية. نحن نعمل على تحسين مطابقة معامل الانكسار ، مع استخدام وسائل أخرى للالمجهري ، وتجديد المشبعة mountant خلال التجارب الزمني الطويل. ونحن ندرك أيضا ، على الرغم من أن واحدة من المزايا الرئيسية لبالفلور ، ويجري وهي خاملة بيولوجيا والجانب الثاني. بالفلور لا تذوب بسهولة الجزيئات البيولوجية مما يعني أيضا أنه لا يمكن استخدامها بسهولة لتوفير مركبات ذات الأهمية مثل الهرمونات ، والمخدرات ، والجزيئات الصغيرة الأخرى أو الأيونات.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
فإن الكتاب أود أن أشكر البروفيسور نيكولاس سميرنوف من جامعة اكستر لنصيحته ، وجامعة اكستر مرفق Bioimaging. وقدم التمويل من جانب المملكة المتحدة الحيوية والعلوم الحيوية مجلس البحوث (منحة مرجع BB/E002682/1).
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
| Perfluorodecalin | F2 Chemicals | N/A | Telephone to order. |
| Carolina Observation Gel | Blades Biological | 13-2700 |
References
- Inoue, S., Pawley, J. P. Foundations of Confocal Scanned Imaging in Light Microscopy. Handbook of Biological Confocal Microscopy, 3rd. , 1-16 (2006).
- Littlejohn, G. R., Gouveia, J. D., Edner, C. S. m. i. r. n. o. f. f., N, ., Love, J. Perfluorodecalin substantially improves confocal depth resolution in air-filled tissues. New. Phytologist. 186, 1018-1025 (2010).
- Sargent, J. W., Seffl, R. J. Properties of perfluorinated liquids. Fed. Fed. Proc. 29, 1699-1703 (1970).
- Schönherr, J., Bukovac, M. J. Penetration of stomata by liquids. Plant Physiol. 49, 813-819 (1972).
- Davies, M. W. Liquid ventilation. Paediatr. Child. Health. 35, 434-437 (1999).
- Shaffer, T. H., Wolfson, M. R., Greenspan, J. S., Hoffman, R. E., Davis, S. L., Clark, L. C. Liquid ventilation in premature lambs: uptake, biodistribution and elimination of perfluorodecalin liquid. Reprod. Fertil. Dev. 8, 409-416 (1996).
- Crafoord, S., Larsson, J., Hansson, L. J., Carlsson, J. O., Stenkula, S. The use of perfluorocarbon liquids in vitreoretinal surgery. Acta. Ophthalmol. Scand. 73, 442-445 (1995).
- Lowe, K. C. Engineering blood: synthetic substitutes from fluorinated compounds. Tissue Eng. 9, 389-399 (2003).
- Wardrop, J., Edwards, C. M., Lowe, K. C., Davey, M. R., Power, J. B. Cellular responses of plant protoplasts to culture with oxygenated perfluorocarbon. Adv. Exp. Med. Biol. 428, 501-505 (1997).
- Sukumaran, N. P., Quamme, H., Weiser, C. J. Use of fluorocarbons to study freezing in plant tissues. Plant Physiol. 50, 632-634 (1972).
- Nagai, T., Ibata, K., Park, E. S., Kubota, M., Mikoshiba, K., Miyawaki, A. A variant of yellow fluorescent protein with fast and efficient maturation for cell-biological applications. Nat. Biotechnol. 20, 87-90 (2002).
- Baker, N. R. Chlorophyll fluorescence: a probe of photosynthesis in vivo. Annu. Rev. Plant. Biol. 59, 89-113 (2008).
