Orthogonale Protein Purification Gesteund door een Small Bispecifieke Affiniteit Tag

1. Klonen van het doel gene/ABDz1-tagged fusieconstruct Bereid PCR-fragmenten van de ABDz1 gen geflankeerd door geschikte restrictie-plaatsen voor N-terminale ligatie van het doelwitgen in de expressie plasmide (een plasmide dat ABDz1 is vrij beschikbaar via een Material Transfer Agreement). Cleave gezuiverde expressievector en PCR fragmenten met gekozen restrictie-enzymen in een geschikte reactie buffer. Zuiver de producten vóór ligatie. Afbinden van de beperkte ABDz1 fragment in de expressievector die het gen van interesse en transformeren de ligatie product tot en met E. coli (in de originele methode van de RR1ΔM15 stam werd gebruikt 8). Verspreid getransformeerde cellen op agar platen aangevuld met geschikte antibiotica voor selectie. PCR-scherm een ​​paar kolonies en volgorde controleer de resulterende expressiecassette door DNA-sequencing. Bereid plasmide van een 's nachts de cultuur van een reeks verifIED kolonie en om te zetten in de gewenste expressie stam (in de oorspronkelijke methode E. coli Rosetta (DE3), hosting een pRARE plasmide om de productie van eiwitten gecodeerd worden door menselijke genen te verbeteren, werden gebruikt). 2. Eiwitexpressie Inoculeren een enkele bacteriële kolonie in 10 ml van tryptische soja bouillon aangevuld met 5 g / l gistextract en de juiste antibiotica. Incubeer bij 150 tpm bij 37 ° C gedurende de nacht. Inoculeren 1 ml overnacht cultuur in 100 ml vers medium en induceren proteïne-expressie (oorspronkelijk 1 mM isopropyl-β-D-thiogalactoside bij een lac operon werd gebruikt), wanneer de cellen bereiken de logaritmische groeifase. Incubeer bij 150 tpm bij 25 ° C gedurende de nacht en de oogst cellen door centrifugeren. 3. Orthogonale affiniteitszuivering Resuspendeer de pellet in 25 ml lopen buffer (25 mM Tris-HCl, 200 mM NaCl, 1 mM EDTA, 0,05% (w / v) Tween 20, pH 8,0) en verstoren ee cellen door sonicatie op 60% amplitude en 1.0/1.0 pulsen gedurende 3 minuten. Centrifugeer het monster en filter het doelwit eiwit bevattende supernatant (0,45 pm) voor verdere zuivering. Equilibreren ofwel een 1 ml HSA Sepharose kolom of een NHS-geactiveerde column, die eerder samen met HSA volgens de leverancier de aanbevelingen, met 10 kolomvolumes (CV) van het runnen van buffer bij 1 ml / min op een geschikte eiwitzuivering systeem. Laad de bacteriële lysaat bij 0,5 ml / min en vervolgens het debiet weer op 1 ml / min. Was de kolom met 5 CV van lopende buffer, gevolgd door 5 CV van wassen buffer (5 mM NH 4 Ac, pH 5,5). Elueer het monster met elutiebuffer (0,5 M HAc, pH 2,5) op 1 ml / min en het verzamelen van fracties, monitor absorptie bij 280 nm tot fracties van de geëlueerde piek voor verdere zuivering te selecteren. Zwembad de fracties met de hoogste eiwitconcentratie, verdunnen twee keer in SuRe lopen buffer (20 mM fosfaat, 150 mM NaCl, pH 7,2) enZorg ervoor dat de pH-waarde is ongeveer neutraal. Voeg 1 M Tris-HCl pH 8 tot pH, indien nodig te verhogen. Laad de steekproef op 0,5 ml / min op een 1 ml HiTrap MabSelect SuRe kolom die is geëquilibreerd met 10 CV van Sure draait buffer is op 1 ml / min. Reset het debiet tot 1 ml / min na het laden. Was de kolom met 5 CV van Sure lopen buffer (stap 5) en elueer de eiwitten met 0,2 M HAc, pH 2,7. Voor gevoelige doeleiwitten het eluaat kan direct worden geneutraliseerd bij de inzameling door toevoeging van Tris-HCl. Als de chromatografische stappen omgekeerd het eluaat uit de MabSelect SuRe kolom kan worden verdund in rijklare buffer (stap 3.1) en de pH verhoogd tot ongeveer 8 door toevoeging van 1 M Tris-HCl. In het algemeen worden smaller pieken waargenomen wanneer de Sure matrix is ​​werkzaam in de tweede stap. 4. Evaluatie van de zuiverheid natriumdodecylsulfaat polyacrylamide gel elektroforese (SDS-PAGE) Laad de gezuiverde fracties op eenreducerende SDS-PAGE en, indien gewenst, het molecuulgewicht van het gezuiverde product te analyseren met behulp van massaspectrometrie. Het is belangrijk om volledig te verminderen, omdat het monster een gratis cysteine ​​in ABDz1 kan dimerisatie van het product veroorzaken onder niet-reducerende omstandigheden. 5. Representatieve resultaten: Als een proof of principle, was orthogonale affiniteitszuivering vergemakkelijkt door het ABDz1 tag beoordeeld op drie menselijke doeleiwitten vertegenwoordigers van verschillende oplosbaarheid klassen, molecuulgewichten en iso-elektrische punten (tabel 1). De ABDz1 gen werd genetisch gefuseerd met het doel genen en de constructen werden uitgedrukt in E. coli, Figuur 2 toont een stroomschema voor alle stappen in de methode achtereenvolgens. Na zuivering door de orthogonale protocol, werden monsters verzameld op verschillende punten geanalyseerd door SDS-PAGE (figuur 3). De resultaten tonen duidelijk het nut van een dual-tag en twee zeer specifieke zuiveringsstappen. Ook al redelijk zuiver is achieved na de eerste zuiveringsstap gezien vanaf de gels, de opeenvolgende stap resulteert in een zeer zuiver product geschikt voor veeleisende toepassingen. Figuur 1. Ontwerp van de combinatorische bibliotheek wordt gebruikt voor de selectie van het bispecifieke ABDz1 tag. De 46 aminozuur albumine-bindend domein vouwen tot een stabiele drie helix bundel en het bevat een bindingsplaats voor menselijk serum albumine voornamelijk gelegen aan de tweede helix. Door genetisch randomizing elf oppervlak blootgesteld aminozuren zich in de eerste en de derde helix, was een nieuw bindend oppervlak ontworpen. De elf posities zijn aangegeven in de figuur en genummerd volgens Kraulis et al.. 9. Naar aanleiding van biopanning tegen een dimeer van het Z-domein van Staphylococcus proteïne A met de combinatorische bibliotheek tot expressie gebracht op faag, het bispecifieke ABDz1 molecule werd geïdentificeerd. <img alt = "Figuur 2" src = "/ files/ftp_upload/3370/3370fig2.jpg" /> Figuur 2. Een vereenvoudigd stroomschema voor de orthogonale affiniteitszuivering protocol. Een PCR-fragment dat het ABDz1 volgorde wordt geligeerd (N-terminaal) met een gen van interesse in een geschikte expressievector. De ligatie product wordt getransformeerd tot E. coli voor sequentie verificatie en plasmide voorbereiding. Na transformatie naar een uitdrukking host, is een grootschalig cultuur voor recombinant eiwit expressie opgezet vanuit een eerste overnachting cultuur. Bacteriën worden geoogst door centrifugeren en gelyseerd door sonicatie om bacteriële lysaat die het doelwit eiwit te produceren. Na een filtratie stap om resterende vaste deeltjes te verwijderen, is het lysaat onderworpen aan orthogonale affiniteit zuivering op een liquid handling systeem door het ondergaan van twee zuiveringsstappen achter elkaar. Geëlueerd pieken van beide zuivering stappen zijn bemonsterd en beoordeeld door SDS-PAGE om zuiverheid te beoordelen en ten opzichte van thij lysaat vóór de zuivering. Figuur 3. SDS-PAGE-analyse van target eiwitten tot expressie gebracht en gezuiverd in de fusie met ABDz1. Monsters genomen van de bacteriële lysaat van drie eiwitten, uitgedrukt in fusie te ABDz1, die verschillende eigenschappen, en de ABDz1 tag zelf zijn verzameld, samen met monsters van de overeenkomstige pieken van de reiniging op een HSA-kolom gevolgd door een MabSelect Sure-kolom (A) . Rijstroken 1-4 vertegenwoordigen monsters van lysaten vóór de zuivering, lanen 5-8 van de HSA-zuivering (eerste stap) en steegjes 9-12 van de MabSelect SuRe zuivering (tweede stap). Monsters zijn geladen in de volgende volgorde: ABDz1-141377, ABDz1-HT875, ABDz1-HT2375 en ABDz1. Daarnaast werden monsters verkregen uit dezelfde lysaten gezuiverd in de omgekeerde volgorde op dezelfde kolommen geanalyseerd (B). Lanen 1-3 vertegenwoordigen monsters van lysaten vóór de zuivering, lanen 4-6 from MabSelect Sure-zuivering (eerste stap) en lanen 7-9 van de HSA-zuivering (tweede stap). Monsters werden geladen in dezelfde volgorde als in (A), maar de tag zelf is niet inbegrepen. Uit deze resultaten is het duidelijk dat deze twee-staps methode sterk gezuiverde eiwitten levert, ongeacht de volgorde waarin de stappen worden toegepast. Naam b Doelwiteiwit Uniprot c Moleculair gewicht (kDa) Oplosbaarheid Klasse D Moleculair gewicht van fusie-product (kDa) Iso-elektrische punt van fusie-product 141377 B7Z315 17,4 4 23,7 8.5 HT875 P01040 10,8 3 17,1 4.9 HT2375 P00740 8.9 5 15,2 6.8 Moleculair gewicht van ABDz1 tag alleen al is 6,3 kDa, iso-elektrisch punt 6.7. Doelwit eiwit vertegenwoordigt een deel van de Uniprot eiwit. http://www.uniprot.org . Oplosbaarheid klasse van eiwitfragment met N-terminale Zijn 6 ABP 10. Tabel 1. Target eiwitten en fusion producten met ABDz1 tag een geëvalueerd in een proof of principle studie. Drie unieke humane eiwitten met verschillende moleculair gewicht, oplosbaarheid en iso-elektrisch punt werden gekozen voor expressie en zuivering door de orthogonale affiniteit aanpak.