Ортогональные очистки белков Ведущий: Малый Биспецифичные тегов Affinity

1. Клонирование целевой gene/ABDz1-tagged слияние построить Подготовка ПЦР фрагментов гена ABDz1 окружении подходящие сайты рестрикции для N-терминал лигирования гена-мишени в выражении плазмиды (плазмиды, содержащей ABDz1 находится в свободном доступе через соглашения о передаче материала). Клив очищенной вектор экспрессии и ПЦР-фрагменты с выбрана ферментов рестрикции в подходящем буфере реакции. Purify продукты перед перевязкой. Лигировать ограничено ABDz1 фрагмента в вектор экспрессии, содержащего ген интереса и трансформировать перевязка продукта Е. палочка (в оригинальный метод RR1ΔM15 штамм был использован 8). Распространение трансформированных клеток на агар пластин дополнена подходящими антибиотиками для выбора. ПЦР экране несколько колоний и последовательность проверки полученного выражения кассеты секвенирования ДНК. Подготовка плазмиды из ночной культуры последовательности verifСВУ колонии и перейдем к предпочтительным штамм выражение (в оригинальный метод кишечная палочка Rosetta (DE3), хостинг pRARE плазмиды для улучшения производства белков, кодируемых генами человека, были использованы). 2. Экспрессии белка Привить одну бактериальную колонию в 10 мл бульона триптического соевого с добавлением 5 г / л дрожжевого экстракта и соответствующих антибиотиков. Инкубируйте при 150 оборотов в минуту при температуре 37 ° С в течение ночи. Привить 1 мл ночной культуры в 100 мл свежей среды и вызывают экспрессию белка (первоначально 1 мМ изопропил-β-D-thiogalactoside когда лак оперона была использована), когда клетки достигают логарифмической фазе роста. Инкубируйте при 150 оборотов в минуту при 25 ° С в течение ночи и уборки клетки центрифугированием. 3. Ортогональные очистки сродством Ресуспендируют гранул в 25 мл работает буфера (25 мМ Трис-HCl, 200 мМ NaCl, 1 мМ ЭДТА, 0,05% (вес / объем) Твин-20, рН 8,0) и разрушают йэлектронной клетки ультразвуком при 60% амплитуды и 1.0/1.0 импульсов в течение 3 мин. Центрифуга образца и фильтр целевой белок, содержащий супернатант (0,45 мкм) перед дальнейшей очистки. Уравновешиваться либо 1 мл HSA Sepharose колонки или NHS-активированной колонки, ранее в сочетании с ЧСА в соответствии с рекомендациями поставщика, по 10 столбцов объема (CV) ведения буфером на 1 мл / мин на подходящей системы очистки белков. Нагрузка бактериальный лизат на 0,5 мл / мин, а затем сбросить скорость потока до 1 мл / мин. Вымойте колонки с 5 CV ведения буфера затем 5 CV стиральных буфера (5 мМ NH 4 Ac, рН 5,5). Элюирования образца с элюции буфера (0,5 М НАс, рН 2,5) на 1 мл / мин и собирают фракции, контролировать поглощения при 280 нм, чтобы выбрать из фракции элюировали пик для дальнейшей очистки. Бассейн фракций с высокой концентрацией белка, развести два раза Конечно работает буфера (20 мМ фосфата, 150 мМ NaCl, рН 7,2) иубедитесь, что рН составляет около нейтральной. Добавьте 1 М Трис-HCl рН от 8 до увеличения рН, если необходимо. Нагрузка образца при 0,5 мл / мин на 1 мл HiTrap MabSelect Конечно столбец, который был уравновешенную 10 CV верных работает буфер в 1 мл / мин. Сброс скорости потока до 1 мл / мин после загрузки. Вымойте колонки с 5 CV верных буфер работает (шаг 5) и элюируются белков с 0,2 М НАс, рН 2,7. Для чувствительных белков целевой элюата может быть нейтрализована непосредственно на коллекции путем добавления Трис-HCl. Если хроматографических стадий поменялись местами элюата из MabSelect Конечно, колонка может быть разведен в управлении буфер (шаг 3,1) и рН увеличилось примерно до 8 добавлением 1 М Трис-HCl. В целом, более узкие пики наблюдаются при Конечно матрица используется на втором этапе. 4. Оценка чистоты додецилсульфата натрия полиакриламидном геле (SDS-PAGE) Нагрузка на очищенные фракциисокращение SDS-PAGE и, при желании, анализировать молекулярный вес очищенный продукт масс-спектрометрии. Важно в полной мере уменьшить образца с свободных цистеина в ABDz1 может привести к димеризации продукт, не связанных с восстановительными условиями. 5. Представитель Результаты: Как доказательство принципа, ортогональные очистки близость способствует теги ABDz1 была оценена на три человеческие белки цель, представляющих различные классы разрешимости, молекулярный вес и изоэлектрической точки (табл. 1). Ген ABDz1 был слит с генетически генов-мишеней и конструкции были выражены в E.coli, Рисунок 2 показывает схему для всех шагов в методе последовательно. После очистки ортогональных протокол, взятых в различных точках были проанализированы SDS-PAGE (рис. 3). Результаты ясно показывают, полезность двойную метку и две очень конкретные шаги очистки. Хотя разумные чистоты переменного токаhieved после начальной стадии очистки, как видно из гелей, последующий шаг дает очень чистый продукт хорошо подходит для очень требовательных приложений. Рисунок 1. Дизайн комбинаторная библиотека, используемая для выбора биспецифичные ABDz1 тега. 46 аминокислот белка-связывающий домен складки в стабильной три спирали пучок и она содержит сайт связывания сывороточного альбумина человека в основном расположены на второй спирали. По генетически случайной одиннадцать поверхность подвергается аминокислот находится в первой и третьей спирали, роман обязательными поверхность была спроектирована. Одиннадцать Должности указаны на рисунке и пронумерованы в соответствии с Kraulis и соавт. 9. После biopanning против димера Z-область Стафилококковый белка с комбинаторной библиотеки, выраженные на фаг, биспецифичные ABDz1 молекулы выявлено не было. <iмг ALT = "Рисунок 2" SRC = "/ files/ftp_upload/3370/3370fig2.jpg" /> Рисунок 2. Упрощенная схема для ортогональных протокол очистки близости. ПЦР-фрагмент, содержащий последовательность ABDz1 лигируют (N-конца) с интересующего гена в подходящий вектор экспрессии. Перевязка продукта трансформируется в E. палочка для проверки последовательности и плазмидной ДНК. После перехода к выражению хозяина, крупномасштабные культуры рекомбинантного белка выражение установлена ​​в пределах от начальной ночной культуры. Бактерии собирают центрифугированием и лизировали с помощью ультразвука для получения бактериального лизата содержащие целевого белка. После фильтрации шаг для удаления остатков твердых частиц, лизат подвергается очистке ортогональных близости от системы жидкостного обработки, подвергаясь две стадии очистки подряд. Элюировали пики с обеих стадий очистки отбираются и оцениваются SDS-PAGE для оценки чистоты и по сравнению с тон лизат перед очисткой. Рисунок 3. SDS-PAGE анализа белков-мишеней выражается и очищается в слиянии с ABDz1. Образцы, взятые от бактериальных лизат из трех белков выражается в слиянии с ABDz1, представляющих различные свойства и ABDz1 сам тег были собраны вместе с образцами из соответствующих пиков от очистки на HSA-столбца, после которого MabSelect Sure-столбец () . Дорожки 1-4 представляют собой образцы из лизатов до очистки, полосы 5-8 из HSA-очистки (первая ступень) и переулков 9-12 из MabSelect Конечно очистки (вторая ступень). Образцы загружаются в следующем порядке: ABDz1-141377, ABDz1-HT875, ABDz1-HT2375 и ABDz1. Кроме того, образцы, приобретенные у же лизатов очищенных в обратном порядке на том же колонны были проанализированы (B). Дорожки 1-3 представляют собой образцы из лизатов до очистки, переулков 4-6 ером MabSelect Конечно очистки (первая ступень) и переулков 7-9 из HSA-очистки (вторая ступень). Образцы были загружены в том же порядке, как в (), но сам тег не входит. Из этих результатов ясно, что этот двухступенчатый метод дает высокоочищенные белки, независимо от порядка, в котором шаги применяются. Имя б Белка-мишени Uniprot с Молекулярный вес (кДа) Растворимость Класс D Молекулярный вес плавления продукта (кДа) Изоэлектрическая точка плавления продукта 141377 B7Z315 17,4 4 23,7 8,5 HT875 P01040 10,8 3 17,1 4,9 HT2375 P00740 8,9 5 15,2 6,8 Молекулярный вес ABDz1 теги только на 6,3 кДа, изоэлектрической точке 6.7. Целевой белок представляет собой часть белка Uniprot. http://www.uniprot.org . Растворимость класс белков фрагмента с N-терминал Его 6 ABP 10. Таблица 1. Целевая белков и продуктов синтеза с ABDz1 теги оценивается в доказательство принципа исследования. Три уникальных белков человека с различной молекулярной массы, растворимость и изоэлектрической точки были выбраны для выражения и очистки ортогональных подход близости.