بناء منخفض الميزانية Axotomy نظام ليزر لدراسة التجديد في أكسون C. ايليجانس</em
Summary
الليزر axotomy تليها الوقت الفاصل بين التصوير هو وسيلة حساسة للفحص آثار الطفرات في<em> C. ايليجانس</em> على محور عصبي التجدد. وذات جودة عالية ، ولكن غير مكلفة ، ويمكن نظام الليزر التذرية وأضاف بسهولة في معظم المجاهر. الفاصل الزمني التصوير أكثر من 15 ساعة يتطلب تجميد حذرا من الدودة.
Abstract
الليزر axotomy تليها الوقت الفاصل بين المجهري هو الفحص عن الظواهر الحساسة التجدد محوار في C. ايليجانس 1. والصعوبة الرئيسية من هذا الاختبار هو التكلفة المتصورة (25 دولارا – 100K) والخبرات الفنية اللازمة لتنفيذ نظام ليزر 2،3 الاجتثاث. ومع ذلك ، يمكن ليزر الحالة الصلبة نبضة من التكاليف المتواضعة (<$ 10K) توفير الأداء القوي للالتذرية الليزر في التحضيرات شفافة حيث المحاور المستهدفة هي "قريبون" من سطح الأنسجة. ويمكن تحقيق المواءمة بين البناء ونظام في يوم واحد. المسار الضوئي التي تقدمها الضوء من المكثف تركيزا على الليزر التذرية يوفر دليلا محاذاة مريحة. يمكن أن تكون مكرسة وحدة وسيطة مع جميع بصريات الليزر لإزالة التذرية ، ويؤكد أن الحاجة لا يمكن نقل العناصر البصرية خلال الدورة الليزر التذرية. A مزدوج اللون في وحدة وسيطة يسمح التصوير في وقت واحد والتذرية الليزر. تركز شعاع الليزر رس الشعاع الصادر من عدسة المجهر المكثف تركيزا دلائل التوافق المبدئي للنظام. وتستخدم مجموعة متنوعة من العدسات لشرط وتوسيع شعاع الليزر لسد الفتحة الخلفية للعدسة الهدف الذي تم اختياره. يتم تنفيذ التوافق النهائي والاختبار مع جبهة الهدف معكوسة سطح شريحة زجاجية. يتم ضبط قوة الليزر لإعطاء الاجتثاث أدنى حجم البقعة (<1um). وتتركز بقعة الاجتثاث مع تعديلات دقيقة للمرآة الماضي شنت kinematically لعبور الشعر ثابتة في إطار التصوير. الليزر سوف تكون السلطة لaxotomy 10X تقريبا أعلى من اللازم لأدنى بقعة الاجتثاث على الشريحة المستهدفة (قد تختلف مع هذا الهدف الذي تستخدمه). يمكن أن يجمد الديدان لaxotomy الليزر والتصوير مرور الزمن من خلال تزايد على منصات agarose (أو في غرف ميكروفلويديك 4). تتم بسهولة مع منصات Agarose agarose 10 ٪ في المياه المالحة متوازنة ذابت في الميكروويف. يتم وضع قطرة من agarose المنصهر على شريحة زجاجية وسوت مع آخرشريحة زجاجية في لوحة (يتم استخدام طبقة واحدة من الوقت على الشريط الشرائح المتاخمة كفاصل) حوالي 200 ميكرون سميكة. ويستخدم "Sharpie" غطاء لقطع منصة دائرية قطرها النظامية من 13mm. تضاف مخدر (1ul Muscimol 20mM) والمجهرية (كريس فانغ الين اتصال شخصي) (2.65 ٪ 1ul البوليستيرين 0.1 ميكرون في الماء) إلى وسط لوحة تليها 3-5 الديدان الموجهة لذلك هم على جنوبهم اليسرى. ويطبق ساترة الزجاج ومن ثم يتم استخدام الفازلين لختم ساترة ومنع التبخر من العينة.
Protocol
Discussion
هناك العديد من مناقشات جيدة مع الأنظمة المجهرية ليزر ليزر مختلفة 3،5-11. الفيمتو ثانية ليزر الأشعة تحت الحمراء هي "المعيار الذهبي" لالتذرية الليزر التحت خلوية 12 و مريحة اذا المرتبطة منشأة التصوير ، لكنها غالبا ما تكون مكلفة للغاية للمستخدمين الفرديين. إذا كنت تحتاج إلى ليزر الفيمتو ثانية الأشعة تحت الحمراء للتصوير عينتك بسبب عمق التصوير ثم ستحتاج على الارجح واحدة من أجل axotomy الليزر. الأنسجة شفافة مع المحاور المستهدفة في غضون 30-50 ميكرون السطح ربما تكون مجدية مع نبض الليزر الزرقاء والخضراء في نطاق الجامعة الاردنية / 20 نبضة المستهدفة من خلال عدسة عالية الغمر غ. وسوف يكون هناك المزيد من الاضرار الجانبية مع النانو والليزر بيكو الثاني مقارنة مع ليزر الفيمتو ثانية ، خصوصا أن عمق يزيد محوار المستهدفة. جيم ايليجانس شفاف وجميع محاور هي أم في غضون 20-30 من السطح. نقطع بشكل روتيني المحاور الحركية التي يتم في غضون 5 ميكرون من السطح. لدينا أيضا بسهولة خفض الفأسإضافات داخل الحلبة العصبية التي هي حوالي 20 ميكرون من سطح بشرة. وجدنا حد لقطع محاور أن يكون حوالي 30-50 أم من خلال قطره دودة الكبار. فمن المحتمل أن نظام الليزر التذرية وصفها هنا سوف تعمل بشكل جيد مع الاستعدادات المختلفة التي تتلاءم مع معايير الشفافية وعمق المحاور المستهدفة. ومع ذلك ، فإنه هو قليلا من المستغرب ، نظرا للمزايا النظرية ليزر الفيمتو ثانية الأشعة تحت الحمراء ، التي نانو وبيكو ثانية نانومتر 355 و 532 نانومتر ليزر أداء جيدا جدا ليزر axotomy في C. ايليجانس 6،13. نحن لا نرى أي اختلافات في التجدد محوار ردا على axotomy الليزر مع النانوسيكند 440 نانومتر ، النانوسيكند نانومتر 532 ، والليزر الفيمتو ثانية الأشعة تحت الحمراء.
الحالة الصلبة للأشعة فوق البنفسجية 355 نانومتر ليزر نحو نفس تكلفة الصمام الثنائي ضخ 532 نانومتر بسلبية Q – مبدلة ليزر الحالة الصلبة ، ولكنها تتطلب صلاحيات أعلى أو البصرية التي تمر بكفاءة هذه أقصر طول موجي. صممت معظم البصريات لأداء جيدا مع 400 مرئية –700 نانومتر الخفيفة. والليزر 355 نانومتر تقدم بعض المزايا مثل عتبة 6 البلازما مخفضة ، أصغر حجم البقعة ، ومزدوج اللون تمريرة طويلة ومباشرة بكفاءة 100 ٪ من التذرية الليزر إلى الهدف ، والسماح التصوير المتزامن لGFP دون فقدان الإشارة العينة. وأشعة الليزر الزرقاء 440 نانومتر الإبقاء على مزايا العمل مع ليزر الضوء المرئي (الأداء الجيد مع البصريات القياسية والسلامة). لسوء الحظ ، فإن تكلفة تشغيل DPP Q – 440 ليزر الحالة الصلبة نانومتر هي 3 أضعاف تكلفة الليزر 355nm نانومتر أو 532 من قوة مماثلة في هذا الوقت. إذا كنا في وضع نظام جديد لجيم ايليجانس ، حيث عمق الهدف هو الحد الأدنى ، فإننا اختيار عدسة شفافة للأشعة فوق البنفسجية (يكلف نحو 3،000 دولار للعدسة النفط 1.3na 40X مع نفاذية 50-70 ٪ في 355nm) والليزر 355 نانومتر المنتجة UJ 10/05 / نبضة في 1 -20 كيلو هرتز.
ويعتقد محوار الاجتثاث أن ذلك يعود إلى تشكيل البلازما. وسوف أقصر البقول عتبات إنتاج البلازما في خفض استهلاك الطاقة وحجم البلازما ث أن سوء أصغر 6. والهدف هو انتاج البلازما أصغر وأقصر عمرا من خلال تعديل نبض الطاقة إلى أدنى السلطة. وأكبر معمرة البلازما تولد فقاعات التجويف أن الأضرار المحيطة بها الخلايا. لقد وجدنا عموما ان الاجتثاث باستخدام حوالي 5-10 البقول على أعلى تردد (أي 2.5kHz) يعطي أفضل النتائج. هذا يشير إلى أن الضرر يمكن أن تكون متكاملة تدريجيا خلال سلسلة من النبضات لتحسين مراقبة مدى الضرر. نظام الليزر التذرية الموصوفة هنا هو متسامح جدا إذا محاذاة شعاع وتوسعت بشكل دقيق. نبدأ في خفض المحاوير الديدان البالغة في قوة الليزر 10 ٪ (في المتوسط 0.3 ميغاواط في 2500 هرتز يقاس ويقدر UJ 1 / نبض) ويمكن أن يقلل من تلف محدودة من خلال السلطة المحلية 14 ٪. يمكنك مراقبة مناطق أكبر من الضرر 15-39 ٪ طاقة الليزر ، ولكن فقط فوق طاقة بنسبة 40 ٪ (حوالي 1 في المتوسط بنحو 2500 ميغاواط قياس هرتز) لا الديدان تنفجر بسبب فقاعات التجويف الكبيرة والأضرار التي لحقت جليدة الدودة.
e_content "> وآخرون 2010 2 ورقة ممتازة من الموارد لبناء نظام التذرية الليزر. Steinmeyer أفيري ليون أيضا وصفا لطيفة العملي لنظام الليزر التذرية على أساس الغاز N2 غير مكلفة ليزر 337 نانومتر وانه يوفر بعض عملية كبيرة نصيحة (elegans.swmed.edu / Worm_labs / افري /). عند تصميم النظام الخاص بك يجب عليك التحدث أولا مع الممثل الخاص المجهر لتحديد كيفية استهداف الليزر التذرية إلى الهدف المجهر. ينبغي شن المجهر الخاص بك على الاهتزاز جدول العزلة (نيوبورت ، TMI ، ثور). بارز اللوح هو الأمثل ، ولكن لا يزال من أعلى الفولاذ الصلب يمكن استخدامه مع positioners المغناطيسي ألف وحدة مخصصة المتوسطة على نطاق تستقيم هو لطيف لأنه لا يمكن أن تترك جميع العناصر البصرية في مكانها ، إلا أنه قد تكون أقل تكلفة وأكثر ملاءمة لاستخدام منفذ الكاميرا (مقلوب) او "الموحد" تعلق على منفذ البرنامج الموسع للتمنيع ، فلوري ، تحتاج إلى معرفة حجم الفتحة في الظهر والنفاذية (في A blation الليزر الطول الموجي) من عدسة الهدف كنت تنوي استخدامها. بمجرد اتخاذ قرار بشأن ليزر (على سبيل المثال ، Crylas ، زخر ، كريستال ، أو لجنة حقوق الطفل) يجب عليك الاتصال ثور أو نيوبورت للمساعدة في اختيار العناصر الصحيحة البصرية ، وأجهزة ومعدات السلامة. قررنا على المتوسع شعاع الجليل مزدوج لتوفير مساحة ، ولكن أبسط المتوسع كبلر هو خيار (f2/f1 عامل التوسع =). وسوف تكون مخصصة المتوسع شعاع الأقل كلفة ، ولكن نيوبورت ، ثور ، والعديد من الشركات المصنعة ليزر نقدم نوعية ممتازة التجارية شعاع المتوسع. بعض الشركات المصنعة ليزر كما تقدم مخففات اليدوية والتي تسيطر عليها الكترونيا التي قد تكون فعالة من حيث التكلفة وتوفير مساحة ، ولكن ليس تنوعا مثل المستقطب Glan طومسون ونصف لوحة الموجة. وسوف تحتاج أيضا إلى اتخاذ قرار بشأن كيفية السيطرة على الليزر. يمكنك تصميم وحدة تحكم LABVIEW يستند إلى استخدام المولدات TTL التجارية ، أو البرامج التي تقدمها الشركة ليزر. مناقشة الخيارات مع الشركة المصنعة ليزر معينة. خيمة "> لقد قدمنا لائحة من الأجهزة لدينا تستخدم فقط كدليل عام. النظام الموصوفة هنا تكلف حوالي 15000 $ عند إضافتها إلى نظامنا التصوير الموجودة. قسمك الفيزياء المحلية وغالبا ما يكون شخص ما على استعداد لتوفير مقدمة عملية ل العمل بأمان مع شعاع الليزر الحرة.الطرق البديلة لتجميد والفاصل الزمني للتصوير C. وقد وصف مؤخرا ايليجانس (14).
المشاكل
الخطوة الأصعب والأكثر أهمية هو محاذاة شعاع تركز على توسيع المحور البصري للالمجهر. مرة واحدة لديك شعاع تركزت وتوسعت من خلال عدسات الجليل يجب أن نعمل بجد للحصول عليه الانحياز في حدود 5 أم محور المجهر الضوئي وقبل استخدام المرايا لتوجيه محاذاة النهائي للمركز. والإفراط في استخدام المرايا لتوجيه أشعة لمواءمة المجهر نقله خارج المحور من خلال شعاعالمتوسع. USING الحذر الشديد يمكنك التخفيف من شعاع الليزر مع فلتر ND المناسبة وعرضها مباشرة على ملف شعاع الليزر على الهدف العاكسة (المرآة الأمامية السطحية). يمكنك دفع برفق المجهر لمركز شعاع بالتحديد في مجال الهدف من عرض 60X (إذا كان لا يمكن أن تتركز في نطاق يصل إلى أسفل / تحتاج إلى ضبط ارتفاع السكك الحديدية). ويمكن استخدام ملف شعاع لمحاذاة بالضبط محور المجهر الضوئي لإعطاء شعاع التي تركزت دائرية و "مشاعل" متناظر. قنبلة غير المتماثلة هو إشارة إلى أن ليس المحور المجهر المنحازة تماما (أو ليس على مستوى السكك الحديدية). أخيرا ، يجب عليك ضبط L3 وحتى نرى توسعا ومتناظرة والانكماش من الحزم. تركيز المجهر بدقة على سطح الهدف ثم L3 ضبط تركيز شعاع الليزر إلى أصغر بقعة. يجب أن تجد الآن أن شعاع الليزر في غضون 5 ميكرون للمركز عندما التقط عبر LSCM أو نظام CCD وضمن بقعة الاجتثاث1um التركيز Z.
إذا كنت تجد "نسف" الديدان أو توليد فقاعات باستمرار التجويف كبيرة لخفض المحاوير المشكلة هو الأكثر احتمالا محاذاة غرامة الليزر التذرية. تأكد من أن الحد الأدنى (<500nm) هي بقعة الاجتثاث المترجمة إلى التركيز Z (ضبط التقارب مع عدسة L3) والبقعة XY الائتمانية (مع ضبط مرآة الماضي شنت kinematically).
وسوف تستهدف المحاوير أقرب إلى السطح تتطلب طاقة أقل ليزر. وبالمثل ، فإن الحيوانات الصغيرة (L1 و L2) تتطلب طاقة أقل ليزر لaxotomy مقارنة استهداف المحاور نفسها في البالغين.
إذا كان لديك نوع المحاور البرية لا تتجدد أو التبييض المحاور يجب أن تحاول خفض قوة الليزر أو التصوير خفض معدل أخذ العينات. إذا كان لديك الديدان تموت ، أو أن تصبح مريضا حاول تقليل Agarose في المئة في الخطوات من 1 ٪. تأكد من انك لا تتحرك في ساترة الديدان بعد تصاعد لأن هذا سوف يتسبب في كثير من الأحيان إلى الموت عند استخدام عالية فيcentage agarose والمجهرية.
إذا انفجر الديدان الخاص أو يموت خلال جلسة مرور الزمن هو للأسباب التالية : 1. agarose النسبة مرتفعة للغاية. 2. الأضرار التي لحقت إهاب بواسطة الليزر التذرية. 3. حركة ساترة بعد التركيب. إذا كان الضرر الذي يلحق إهاب هو على خطأ فإنه يؤثر فقط على الديدان التي شنت استهدفوا مع الليزر التذرية.
إذا كان لديك دودة تتحرك كثيرا أثناء جلسة مرور الزمن حاول زيادة نسبة agarose في خطوات 0.5 ٪. المحاوير صحية سليمة في الديدان هي دائما "النشط" وعرض على مستوى ثابت من مضان. إذا رأيت انخفاض مفاجئ في مضان أو نشاط الدودة تموت او ميتا. محاور متعددة من الخرز أو مجزأة هي علامة مؤكدة على دودة الموت أو ميتا.
إذا كان لديك مشاكل في الحفاظ على المحاور الخاص في التركيز خلال الدورة بأكملها الفاصل الزمني قد تكون هناك مشاكل عديدة ومختلفة. الاختيار الأول الخاص الانجراف مرحلة من مراحل التصوير عينة خاملة على شريحة زجاجية أكثر من 10 ساعةروبية. قد يكون الانجراف ميكرون قليلة بسبب عدم الاستقرار الحراري ، ولكن أكبر من 5 ميكرون وربما يرجع ذلك إلى القضايا الميكانيكية مع مجهر الخاص. مع تصاعد المشاكل هي أكثر شيوعا. اسمحوا الديدان الخاص شنت يوازن مع مرحلة المجهر الخاص لمدة 30 دقيقة قبل بدء انقضاء الوقت الخاص. تأكد من أن الختم الخاص الفازلين لم تتطور تسرب أثناء وقتك انقضاء الدورة.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وأيد هذا البحث من قبل مؤسسة العلوم الوطنية ، وصندوق الوقف ماكنايت علم الأعصاب ، وكريستوفر ودانا ريف وAmerisure مؤسسة الخيرية.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
|---|---|---|---|
| 535 nm Laser | Crylas | FDSS532Q3 | (TEEM, Crystal, and CRC also offer comparable lasers) |
| All optics and hardware | (Thor offers comparable optics and hardware) | ||
| SUPREMA Optical Mount, 1.0-in diameter | Newport | SS100-F2KN | 2 |
| 1″ diameter post, 1″ height | Newport | PS-1 | 1 |
| 1″ diameter post fork | Newport | PS-F | 1 |
| Achromatic Zero-Order Wavel Plate, ½ Wave Retardation, 400-700nm | Newport | 10RP52-1 | 1 |
| Rotation Stage, 1″ Aperature | Newport | RSP-1T | 1 |
| 1″ diameter post, 1″ height | Newport | PS-1 | 1 |
| 1″ diameter post fork | Newport | PS-F | 1 |
| Glan-Laser Calcite Polarizer, 430-700nm | Newport | 10GL08AR.14 | 1 |
| Polarizer Rotation Mount | Newport | RM25A | 1 |
| ¼” spacer for 1″ diameter post | Newport | PS-0.25 | 1 |
| ½” height, 1″diameter post | Newport | PS-0.5 | 1 |
| Fork, 1″ diameter post | Newport | PS-F | 1 |
| Beam Dump | Newport | PL15 | 1 |
| Microscope Objective Lens Mount | Newport | LH-OBJ1 | 1 |
| 1″ diameter post, 1″ height | Newport | PS-1 | 1 |
| 1″ diameter post fork | Newport | PS-F | 1 |
| High-Energy Nd:YAG Laser Mirror, 25.4 mm Diameter, 45°, 532 nm | Newport | 10Q20HE.2 | 4 |
| SUPREMA Optical Mount, 1.0 inch diameter, clearance mounting hole | Newport | SN100C-F | 2 |
| High Precision Knob Adjustment Screw, 12.7mm travel, 100TPI | Newport | AJS100-0.5K | 4 |
| Thread adaptor, ¼-20 male, 8-32 female | Newport | SS-1-B | 2 |
| Rod Clamp for 1.5 inch diameter rod | Newport | 340-RC | 2 |
| Rod, 14 inch (35.5 cm) tall | Newport | 40 | 1 |
| Rail carrier for X26, square 40mm length | Newport | CN26-40 | 4 |
| Steel Rail, 384mm (15″) length | Newport | X26-384 | 1 |
| Rod Platform for 1.5 inch diameter rod | Newport | 300-P | 2 |
| Rod, 14 inch (35.5 cm) tall | Newport | 40 | 2 |
| Plano-Concave Lens, 12.7mm diameter, -25mm EFL, 430-700nm | Newport | KPC025AR.14 | 2 |
| Plano-Convex Lens, 25.4mm diameter, 50.2mm EFL, 430-700nm | Newport | KPX082AR.14 | 1 |
| Plano-Convex Lens, 25.4mm diameter, 62.9mm EFL, 430-700nm | Newport | KPX085AR.14 | 1 |
| Fixed Lens Mount, 0.5″ diameter, 1.0″ Axis height | Newport | LH-0.5 | 2 |
| Fixed Lens Mount, 1.0″ diameter, 1.0″ Axis height | Newport | LH-1 | 2 |
| Microspheres 0.1um | Polysciences | 00876 | |
| Agarose | RPI | A20090 | EEO matters |
| Muscimol | Sigma | M1523 |
References
- Hammarlund, M., Nix, P., Hauth, L., Jorgensen, E. M., Bastiani, M. Axon regeneration requires a conserved MAP kinase pathway. Science. 323, 802-806 (2009).
- Steinmeyer, J. D. Construction of a femtosecond laser microsurgery system. Nature protocols. 5, 395-407 (2010).
- Wu, Z. Caenorhabditis elegans neuronal regeneration is influenced by life stage, ephrin signaling, and synaptic branching. Proc Natl Acad. 104, 15132-15137 (2007).
- Gilleland, C. L., Rohde, C. B., Zeng, F., Yanik, M. F. Microfluidic immobilization of physiologically active Caenorhabditis elegans. Nature protocols. 5, 1888-1902 (2010).
- Raabe, I., Vogel, S. K., Peychl, J., Tolic-Norrelykke, I. M. Intracellular nanosurgery and cell enucleation using a picosecond laser. J. Microsc. 234, 1-8 (2009).
- Hutson, M. S., Ma, X. Plasma and cavitation dynamics during pulsed laser microsurgery in vivo. Physical review letters. 99, 158104-158104 (2007).
- Venugopalan, V., Guerra, A., Nahen, K., Vogel, A. Role of laser-induced plasma formation in pulsed cellular microsurgery and micromanipulation. Physical review letters. 88, 078103-078103 (2002).
- Bourgeois, F., Ben-Yakar, A. Femtosecond laser nanoaxotomy properties and their effect on axonal recovery in C. elegans. Opt Express. 16, 5963-5963 (2008).
- O’Brien, G. S., Rieger, S., Martin, S. M., Cavanaugh, A. M., Portera-Cailliau, C., Sagasti, A. Two-photon axotomy and time-lapse confocal imaging in live zebrafish embryos. J. Vis. Exp. (24), e1129-e1129 (2009).
- Tsai, P. S. Plasma-mediated ablation: an optical tool for submicrometer surgery on neuronal and vascular systems. Curr. Opin. Biotechnol. 20, 90-99 (2009).
- Chung, S. H., Clark, D. A., Gabel, C. V., Mazur, E., Samuel, A. D. The role of the AFD neuron in C. elegans thermotaxis analyzed using femtosecond laser ablation. BMC Neurosci. 7, 30-30 (2006).
- Shen, N. Ablation of cytoskeletal filaments and mitochondria in live cells using a femtosecond laser nanoscissor. Mech. Chem. Biosyst. 2, 17-25 (2005).
- Rao, G. N., Kulkarni, S. S., Koushika, S. P., Rau, K. R. In vivo nanosecond laser axotomy: cavitation dynamics and vesicle transport. Opt. Express. 16, 9884-9894 (2008).
- Rohde, C. B., Yanik, M. F. Subcellular in vivo time-lapse imaging and optical manipulation of Caenorhabditis elegans in standard multiwell plates. Nat. Commun. 2, 271-271 (2011).
