Summary

Analyse der Trunk Neural Crest Cell Migration mit Hilfe eines modifizierten Zigmond Chamber Assay

Published: January 19, 2012
doi:

Summary

Ein Ansatz, um die Migration von explantierten Zellen (Stamm Neuralleistenzellen) analysieren beschrieben. Dieses Verfahren ist kostengünstig, leicht, und in der Lage zu unterscheiden Chemotaxis sowohl Chemokinese und andere Einflüsse auf wandernde Polarität wie die von Zell-Zell-Wechselwirkungen innerhalb des primären Stamm Neuralleiste Zellkultur abgeleitet.

Abstract

Neuralleistenzellen (NCC) ist eine transiente Population von Zellen, die in Entwicklung von Wirbeltieren, dass aus dem dorsalen Neuralrohr (NT) auswandern nach Durchlaufen eines epithelial-mesenchymale Transition 1,2. Nach EMT, migrieren NCCs große Entfernungen entlang stereotypes Wege, bis sie ihre Ziele zu erreichen. NCCs differenzieren sich in einer Vielzahl von Zelltypen, einschließlich Neuronen, Glia, Melanozyten und Chromaffinzellen 1-3. Die Fähigkeit von NCCs zu erreichen und erkennen ihre richtigen Zielregionen für die entsprechende Ausbildung aller Strukturen mit trunk NCC-abgeleiteten Komponenten 3 grundlegend. Aufklärung der Mechanismen von Leitlinien für Trunk NCC Migration hat deshalb eine Angelegenheit von großer Bedeutung. Zahlreiche Moleküle nachgewiesen, dass NCC Migration 4 führen. Beispielsweise werden Trunk NCCs bekanntermaßen von negativen Führung Zeitgeber wie Semaphorin, Ephrin und Slit Liganden 5-8 abgestoßen werden. Allerdings sind nichtbis vor kurzem keine Lockstoffe des Rumpfes NCCs identifiziert worden 9.

Herkömmliche Ansätze zur in vitro Untersuchung der chemotaktischen Verhalten von adhärenten Zellen funktionieren am besten mit immortalisierten, homogen verteilt Zellen, sind jedoch schwieriger zu bestimmten primären Stammzellkulturen die zunächst fehlt eine homogene Verteilung und rasch zu unterscheiden (wie NCCs) anzuwenden. Ein Ansatz, um die Verteilung der Stamm NCCs für Chemotaxisstudien homogenisieren ist die Trunk NCCs aus primären NT Explantatkulturen isolieren, dann heben und replate ihnen zu fast 100% konfluent. Dies erfordert jedoch plating Ansatz erhebliche Mengen an Zeit und Mühe, um genügend Zellen Explantation, ist hart und vertreibt trunk NCCs in einem ungleichen Weise wie in in vivo-Bedingungen gefunden.

Hier berichten wir über eine in vitro Ansatz, der in der Lage, Chemotaxis und andere wandernde Reaktionen des Rumpfes NCCs ohne requirin bewerten istga homogene Zellverteilung. Diese Technik nutzt Zeitraffer-Aufnahmen von primären, unbeirrt trunk NCCs in einem modifizierten Zigmond Kammer (ein Standard Zigmond Kammer wird an anderer Stelle 10 beschrieben). Durch Belichten Trunk NCCs am Umfang der Kultur auf eine chemotactant Gradienten, die senkrecht zu ihrer vorhergesagten natürliche Richtung, können Veränderungen in wandernden Polarität durch die angelegte chemotactant Gradienten induzierte detektiert werden. Diese Technik ist kostengünstig, erfordert das Züchten von nur zwei NT je Wiederholung Explantate Behandlung vermeidet rauen Zelle Anheben (wie Trypsinisierung) verlässt Trunk NCCs in eine ähnliche Verteilung in vivo-Bedingungen, verkürzt sich die Zeitspanne zwischen Explantation und Experimente (was wahrscheinlich verringert das Risiko der Differenzierung), und ermöglicht Zeitraffer Auswertung zahlreicher wandernden Merkmale.

Protocol

Ein. Tag 1: Isolierung von Stamm neuronalen Rohre für Übernacht-Kultur auf Deckgläsern Inkubieren chick Eier für 56 h bei 38 ° C. Entfernen Sie die Eier aus der Inkubation, leicht besprühen sie mit 70% Ethanol und dann trocknen lassen. Die Eier öffnen sich in einem UV-sterilisiert Glasschale. Extrahieren Sie jede Embryo aus Dotter und legen Sie sie in chick Ringer. Tun Sie dies, indem zuerst um seine Blutinseln mit gebogenen Schere, dann mit stumpfen Pinzette, wählen Sie die Embryos von sein…

Discussion

Dirigieren Chemotaxis Forschung am Stamm NCCs erwiesen Herausforderung für eine Reihe von Gründen. Trunk NCCs sind eine heterogene Stammzellen Bevölkerung unterscheiden, ob kultivierten langfristigen wird, daher trunk NCCs aus primären Explantation des Stamm-Ebene NT eingeholt werden muss. Herkömmliche Verfahren, die chemotaktische Reaktion von homogen verteilt Zellpopulationen in vitro zu untersuchen sind schwierig auf Trunk NCCs testen, da sie zuerst erforderlich, dass Zellen getrennt und homogen wiederp…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Wir geben besonderen Dank an Lino Kim, Steve Guzman und Ujit Satyarthi für die technische Unterstützung bei der Entwicklung dieser Methode. Myron Hawthorne, Richard Spengel und Roberto Rojas bearbeitet die Kammern verwendet hier und dringend benötigte technische Unterstützung. Bemerkenswert ist, produziert Roberto Rojas Abbildung 4. Wir sind auch dankbar für wertvolle Ratschläge Scott Fraser vor der Entwicklung der oben genannten Chemotaxis Assay. Diese Arbeit wurde teilweise durch eine NIH-MBRS SCORE-5S06GM048680-13 bis MEDB und durch eine Auszeichnung von der CSU, Northridge Diplomarbeit Support Program CW unterstützt.

Materials

Name of the reagent Company Catalogue number Comments (optional)
DMEM Omega Scientific DM-22  
Penicillin Streptomycin Solution Omega Scientific PS-20 100X Stock Concentration
L-Glutamine Omega Scientific GS-60 100X Stock Concentration
Fetal Bovine Serum Omega Scientific FB-11 Lot# 105247 (or another that is comparable)
Modified Zigmond chamber Home made N/A Reservoir volume: ~ 160 μl ea; for additional specifications, see Fig. 4 and the supplemental fabrication protocol
Cell culture dish Denville T6040 40 x 10 mm
Fibronectin BD 354008 10X Stock prepped by diluting 1 mg FN in 1 ml H2O and 9 ml DMEM
Coverslips Fisher 12-548-B Precleaned; 22 x 22 mm
L15 medium Thermo Scientific SH30525.02  
Petroleum Jelly Comforts 011110794642 100%
Centrifuge tube Biologix 10-9152 15 ml
Dispase Cell Systems 4Z0-850 10X Stock Concentration
Syringe BD 309602 1 ml
Needle BD 305127 25 G x 1.5 in.
Alexa Fluor 488-IgM Invitrogen A21042 Stock is 2 mg/ml; 7 moles dye/mole IgM
Dissecting Forceps FST Misc. Dumont #5 or 55; straight tipped; stainless steel or titanium
Tungsten Needle N/A N/A Home made; placed in a pin holder
Blunt Forceps Tiemann 160-18 Used for transferring embryos to Ringer’s from egg yolk

Supplemental Protocol: Fabrication of a Modified Zigmond Chamber

Please refer to Figure 4 as a reference for the protocol below:

  1. Purchase a sheet of 3/16″ thick polished acrylic (4.45 mm actual thickness).
  2. Using a table saw, cut chamber blanks oversized to the rough dimensions of 33.25 mm x 64.57 mm. This allows 3.175 mm extra material for machining.
  3. Set the chamber blank on a vise. With a milling machine and a 6.35 mm (1/4″) end mill bit, finish machining the sides of the chamber to their exact dimensions: 30.07 mm x 61.39 mm.
  4. Position the chamber blank on the milling machine and locate the center of the blank along both the x and y axes with an edge finder; then zero the center location.
  5. Acquire the chamber height (z-axis) by touching the end mill bit to the top surface and zero the height.
  6. Using a 3.91 mm (0.154″) end mill bit, offset the bit 3.03 mm along the x-axis (positive direction) for the first reservoir. Begin machining into the chamber to a depth of 2.84 mm while moving along the y-axis (positive direction) to 7.62 mm (0.300″) and then traverse to 7.62 mm (0.300″) in the opposite (negative) direction to a complete reservoir length of 15.24 mm (0.600″). Offset the bit to 3.03 mm (0.119″) along the x-axis (negative direction) and repeat the same process for the second reservoir.
  7. Position the chamber on its edge and drill a hole using a 1.09 mm (0.043 in.) drill bit on the end of each reservoir (4 total) that connects the end of the reservoir to the side of the chamber for loading medium during experimentation.
  8. Soak the chamber well in warm soapy water to help remove any chemical contaminants.
  9. Soak and rinse the chamber well in double-distilled water to remove any soap. The chambers are now ready to use as described above.

References

  1. Le Douarin, N. M. The avian embryo as a model to study the development of the neural crest: a long and still ongoing story. Mechanisms of Development. 121, 1089-1102 (2004).
  2. Baker, C. V. . Neural Crest and Cranial Ectodermal Placodes. , (2005).
  3. Gammill, L. S., Roffers-Agarwal, J. Division of labor during trunk neural crest development. Dev. Biol. 344, 555-565 (2010).
  4. Kulesa, P. M., Gammill, L. S. Neural crest migration: patterns, phases and signals. Dev. Biol. 344, 566-568 (2010).
  5. Wang, H. U., Anderson, D. J. Eph family transmembrane ligands can mediate repulsive guidance of trunk neural crest migration and motor axon outgrowth. Neuron. 18, 383-396 (1997).
  6. Krull, C. E. Interactions of Eph-related receptors and ligands confer rostrocaudal pattern to trunk neural crest migration. Curr. Biol. 7, 571-580 (1997).
  7. Gammill, L. S., Gonzalez, C., Gu, C., Bronner-Fraser, M. Guidance of trunk neural crest migration requires neuropilin 2/semaphorin 3F signaling. Development, Cambridge, England. , 133-199 (2006).
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  14. Zicha, D., Dunn, G. A., Brown, A. F. A new direct-viewing chemotaxis chamber. Journal of Cell Science. 99, 769-775 (1991).

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Cite This Article
Walheim, C. C., Zanin, J. P., de Bellard, M. E. Analysis of Trunk Neural Crest Cell Migration using a Modified Zigmond Chamber Assay. J. Vis. Exp. (59), e3330, doi:10.3791/3330 (2012).

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