Создание вирусом Эпштейна-Барра роста трансформированных лимфобластоидных клеточных линий

1. ВЭБ массоподготовки Субкультура экспоненциально растущей В95-8 клеток (АТСС CRL # 1612; 13) при 3 х 10 5 клеток / мл в 75 см 2 культуре ткани колбу с использованием стерильной техники. Клетки, выращенные в полной RPMI 1640, содержащей 10% тепла инактивированной эмбриональной телячьей сыворотки (FBS), пенициллина / стрептомицина на 100U/ml и 100 мкг / мл, соответственно, и амфотерицин на уровне 0,5 мкг / мл при 37 ° С в присутствии 5% CO 2. Сорок восемь часов спустя, ресуспендирования клеток в свежей полной RPMI 1640 на 1 х 10 6 клеток / мл. Для стимулирования производства вируса, стимулируют клетки с 20ng/ml tetradecanoyl форбол ацетат (ДТС) в течение 1 часа в стандартной СО 2 инкубатора. Вымойте клетки трижды RPMI 1640, чтобы удалить тонн в год. Ресуспендируют клеток в первоначальный объем полной RPMI 1640 (от 1,2) и поместить колбу в CO 2 инкубаторе в течение 96 часов. Этот метод был показан для получения высоких титров инфекционной номинальной вирусчастиц 6. Центрифуга при 600 х г в течение 10 мин при 4 ° С до отдельных EBV-содержащих супернатант культуры из клеток. Фильтры супернатанта через 0,45-микронный фильтр, Алиготе, и хранить при температуре -70 ° С в течение более года. Альтернативой является получение супернатант из В95-8 клеток, содержащих EBV из АТСС (VR-1492) и использовать в разведении рекомендованных АТСС. 2. Выделение мононуклеарных клеток периферической крови (МКПК) Ничья 10 мл крови от донора в гепаринизированной шприца или гепаринизированной трубки крови. Развести крови с 20 мл PBS при комнатной температуре в 50 мл коническую трубку. Подложка разбавленной крови с 15 мл Ficoll Hypaque лимфоцитов средой разделения. Центрифуга при 225 х г без тормозов при комнатной температуре в течение 30 минут. Удалить лейкомассы и передачи в новый 50 мл коническую трубку. Повышение объема до 50 мл PBS и спина при 600 мкг при комнатной температуре в течение 10 минут. Pouт от супернатант. Вымойте клеток ресуспендирования гранул в 50 мл PBS и вращается со скоростью 600 х г при комнатной температуре в течение 10 минут. Мыть два раза больше в подобной манере. Ресуспендируют отмытых клеток в 1 мл полной RPMI. Используйте 5 мкл клеток для подготовки 1 / 10 разведения в Трипановый синий. Граф живых клеток использованием гемоцитометра. Отрегулируйте громкость с помощью полной RPMI в 25 см 2 колбы культуры ткани для получения концентрации клеток из 2 х 10 6 / мл. 3. Инфекция EBV Добавить FK506 (А. Г. Научно) для клеточной суспензии от 2,6 до конечной концентрации 20 нМ. Место колбу в CO 2 инкубаторе при температуре 37 ° С в течение одного часа. Быстрое таяние аликвоту ВЭБ. Удалить колбу из инкубатора и добавить к EBV клеток в 1 / 10 разведения. Как правило, это разведение обеспечивает МВД 50-100. Swirl колбы перемешать и поместить его в вертикальном положении в CO 2 инкубаторе при температуре 37 ° C. Примечание йна шаге 4, выполнены, чтобы предсказать успех, это необязательный шаг. Если Шаг 4 должны быть выполнены, то вам нужно для инкубации дополнительные колбы ООН-инфицированных РВМС на 2 х 10 6 клеток / мл в качестве контроля. 4. Определение пролиферирующих популяцию клеток (Необязательный шаг) Подготовка FACS буфера: PBS + 5% FBS. Хранить при температуре 4 ° С. Сделайте следующее антител смесей в объеме 50 мкл каждого для окрашивания клеток в шаге 4.6. Антитела разведения должны быть сделаны в FACS буфера, содержащего 1mg/ml мыши IgG (Sigma) для подавления неспецифическое связывание антителами. одной окрашивали PE сопряженных анти-CD23 антител (1 / 50 разбавления) одной окрашивали FITC сопряженных анти-CD58 антител (1 / 50 разбавления) одной окрашивали PE-Cy5 сопряженных анти-CD19 антител (1 / 50 разбавления) тройной окрашивают в течение CD23, CD58, CD19 и (1 / 50 разбавления каждого) одной окрашивали PE сопряженных контроль изотипаантител соответствуют CD23-PE (в той же концентрации, как анти-CD23 антитела) одной окрашивали FITC конъюгированных антител контроль изотипа согласован с CD58-FITC (при той же концентрации, как анти-CD58 антитела) одной окрашивали PE-Cy5 конъюгированных антител контроль изотипа согласован с CD19-PE-Cy5 (при той же концентрации, как анти-CD19 антитела) тройной окрашивали все три антитела изотипа контроля. Временного хранения смесей при температуре 4 ° С в темноте. В третий день после контакта с ВЭБ, мягко водоворот колбу для получения более равномерного клеточной суспензии. Удалить из колбы 2 мл в 2 мл пробирку Эппендорфа. Спиновые трубки в микроцентрифужных при 3000 оборотов в минуту при комнатной температуре в течение 3 минут. Аспирируйте супернатант и ресуспендирования клеток в буфер FACS на 5 х 10 6 до 1 х 10 7 клеток / мл. Удалить восемь 50 мкл аликвоты в отдельных трубок Эппендорф или 96-и V-нижней пластине. Спиновые трубы или пластины при 1500 х гв течение 3 минут. Удалите супернатант и вихревые трубки / пластины. Ресуспендируют клеток в каждой пробирке / лунку в 50 мкл FACS буфера, содержащего соответствующие разведения антител подготовлен в 4.2. Инкубируйте труб / пластин на льду в темноте в течение 30 минут. Центрифуга клеток при 3000 оборотов в минуту в течение 3 минут, удалить супернатант, и добавьте 200 мкл буфера FACS. Центрифуга клетки снова и удалите супернатант для завершения стирки. Повторить еще два стирок. Ресуспендируют клеток в 200 мкл FACS буфера и получить данные с помощью проточного цитометра, приобретя 20 000 событий / трубы. Анализ данных с помощью WinMDI (бесплатный для FACS анализ данных на ПК). Ворота на живые клетки с использованием форвардных и боковые профили разброс. Затем ворота живых клеток на экспрессию CD19 + (В-клеток маркера) после сравнения с клетками окрашивали антителами изотипа контроля соответствуют анти-CD19 антител. Участок CD19 +-клеток жить с интенсивность флуоресценции для CD23 на оси х и интенсивность флуоресценции для CD58 на оси Y.. Определите CD23 + CD58 + и клеток по сравнению с ВЭБ, подвергшихся воздействию клеток, окрашенных соответствие антитела изотипа контроля. Присутствие CD23 привет CD58 +-клеток в ВЭБ, подвергшихся воздействию культуры (рис. 2C) прогнозирует успешный результат ВЭБ-инфицированных роста трансформированных клеток. В противоположность этому, CD23 привет CD58 + клеток не возникают, когда клетки не подвергаются EBV (рис. 2A) или подвергаться без увековечивания штамм EBV (рис. 2В). CD23 + CD58 привет клетки были экспериментально продемонстрировано пройти распространение и впоследствии установить LCL (14). 5. Расширение и криоконсервации LCL Визуализация клеток с помощью световой микроскопии: По неделю после инфицирования EBV, кластеры клеток видны под световым микроскопом. На рисунке 3 показан пример ранних микроскопических кластеров (рис. 3В) в колбу. С течением времени микроскопические кластеры становятся большими, что скопления виднымакроскопически в колбу. Рис 3C показывает большие скопления клеток в установленном LCL с помощью световой микроскопии. Кормление клетки: Двойной объем культуральной среды в культуре колбу на 12 день. Впоследствии расширить культуру, увеличивая его объем в 2-3 раза использованием полной RPMI. Периодичность кормления клетки должны быть определены на основе скорости роста клеток. При культуральной среде становится желтым, как правило, время, чтобы заменить средства массовой информации, что и выше. Как правило, это происходит один раз в неделю. Однако, некоторые клеточные линии, возможно, придется питаться более или менее часто. Развернуть культуры до 75-100 мл в течение ближайших нескольких недель. Криоконсервация: При замораживании до клетки, клетки центрифуге при 600 х г в течение 10 минут при комнатной температуре. Удалить супернатант и ресуспендируют осадок клеток в холодную среду замораживания содержащей 90% FBS и 10% диметилсульфоксида при 1 х 10 7 клеток / мл. Место трубки в жидком азоте. 6. Представитель результаты: Успешный результат предсказывается наличие CD23 + CD58 привет клеток. Примерно 2-3% живых клеток на 3-4 день после контакта с ВЭБ должны иметь эту анкету (рис. 2С). Другие субпопуляции CD23 +, CD23 -, CD58 + и CD58 – клеток наблюдается после контакта с ВЭБ показать минимальное распространение 14. Un-инфицированные клетки (рис. 2A) и клетки подвергаются EBV от HH514-16 клетки (рис. 2В), укрывательство, не увековечивать штамм EBV, не демонстрируют CD23 + CD58 привет клеток. Вы также можете визуализировать клетки с помощью световой микроскопии для контроля успеха: Как упоминалось ранее, в течение недели после инфицирования EBV, небольшие скопления клеток в колбе видны с помощью световой микроскопии (рис. 3В). Как прогрессирует время и клетки развиваются в LCL, микроскопические кластеры становятся крупнее (рис. 3C), что скопления видны макроскопически в колбу. <p claсс = "jove_content"> Рисунок 1. Workflow для генерации и криоконсервации лимфобластоидных клеточных линий. Периферической крови центрифугируют через градиент Ficoll. РВМС присутствует в пальто Баффи установленного градиента подвергаются FK506 с последующим добавлением ВЭБ. EBV, подвергшихся воздействию клетки выращивают при температуре 37 ° С в присутствии 5% CO 2, установить и в дальнейшем расширять LCL для криоконсервации. Рисунок 2. Определение субпопуляции лимфоцитов ожидается пройти распространение после контакта с ВЭБ. Un-инфицированных РВМС () или РВМС подвергается EBV основе HH514-16 клеток (B) или В95-8 клеток (C) в присутствии FK506 было собрано на 3 день. Клетки окрашивали флуорохромом сопряженных антител, направленных против CD19, CD23, CD58 и. После стробирования на живой клеткес, не-инфицированных () и ВЭБ, подвергшихся воздействию (В и С) CD19 +-клетки были исследованы на экспрессию CD23 и CD58. Субпопуляции В-клеток CD58 выражения и высокий уровень CD23 (CD23 привет CD58 +), наблюдается только в клетках, подвергавшихся к трансформации компетентных EBV (производный от В95-8 ячеек), изображен. Рисунок 3. Визуализация клеточных кластеров в ВЭБ-инфицированных клеток. РВМС лечили FK506 и инфицированы EBV. Un-инфицированных (А) и ВЭБ, подвергшихся воздействию (В) клетки были рассмотрены одной недели после заражения фазовый контраст микроскопии (10х увеличение). Пять-недельных клеточной линии лимфобластоидных показано на C.