Epstein - Barr病毒生长转化的淋巴细胞系的建立

1。 EB病毒备料继代培养的急剧增长的一个75厘米2组织培养烧瓶使用无菌技术B95 – 8细胞（ATCC CRL，1612; 13）在3 × 10 5细胞/ ml。细胞是含10％热灭活胎牛血清（FBS），，青霉素/链霉素在100U/ml和100微克/毫升，分别增长完全RPMI 1640和两性霉素B在0.5微克/毫升，37 °的存在彗星5％的CO 2。 四十八小时后，新鲜完整的RPMI 1640悬浮细胞在1 × 10 6细胞/ ml。为了诱使病毒生产，刺激细胞与20ng/ml tetradecanoyl佛波醋酸1小时（TPA）在一个标准的二氧化碳培养箱。用RPMI 1640洗涤细胞3次，以去除TPA。 在原始卷的完全RPMI 1640（1.2）重悬细胞，并将其放置在二氧化碳培养箱96小时烧瓶。这种方法已被证明是产生高滴度的传染性病毒相提并论粒子6。 600 X克离心10分钟，4 ° C，从细胞中分离含有EB病毒培养上清。过滤上清液通过0.45微米的过滤器，分装，并存放于-70 ° C超过一年。 另一种方法是获得从B95 – 8细胞从ATCC（VR – 1492）中含有EB病毒上清，ATCC建议使用稀释。 2。分离外周血单核细胞（PBMC）的从捐助绘制成肝素的注射器或肝素化血管10毫升血。在室温下稀释在50毫升的锥形管的血用20 ml PBS。 底图稀释血液15毫升聚蔗糖Hypaque淋巴细胞分离液。离心225 × 克 ，在室温下30分钟的制动。 删除捉鬼外套和转移到一个新的50 ml锥形管。量提高到50毫升，用PBS，在室温下在600 XG 10分钟旋转。 宝R关闭上清。洗resuspending在50毫升PBS颗粒细胞，在室温和纺纱克600 × 10分钟。洗两次以类似的方式。 1毫升完全RPMI悬浮洗涤细胞。使用5μL细胞准备在台盼蓝的1 / 10稀释。使用一个血球计数活细胞。 在一个25厘米2组织培养瓶使用完全RPMI获得了2 × 10 6 / ml的细胞浓度调节音量。 3。感染EB病毒他克莫司（股份公司科学）的细胞悬液从2.6到终浓度为20纳米。置于容量瓶中， 二氧化碳培养箱在37 ° C为一小时。 迅速解冻EB病毒等分。从孵化器中删除的烧瓶中，EB病毒添加到1 / 10稀释的细胞。通常情况下，这种稀释提供MOI 50-100。旋流烧瓶混合和直立放置在二氧化碳培养箱在37 ° C。 注意日在第4步进行预测成功的结果，是一个可选步骤。如果要执行第4步，你会需要孵育2 × 10 6细胞/毫升作为对照未感染者PBMC中的一个额外的烧瓶。 4。确定细胞增殖人口（可选步骤） 准备流式细胞仪缓冲区：PBS + 5％FBS。保存在4 ° C。 以下抗体各50μL的体积混合染色步骤4.6中的细胞。抗体稀释液应在流式细胞仪含1mg/ml的鼠IgG（Sigma公司）抑制非特异性结合的抗体的缓冲。 单染与PE标记的抗CD23抗体（1 / 50的稀释） 单染色FITC标记的抗CD58抗体（1 / 50的稀释） 单染与PE – Cy5的标记的抗CD19抗体（1 / 50的稀释） 三重染色CD23，CD58和CD19（每1 / 50稀释） 单PE标记的同型对照染色抗体相匹配（在相同浓度的抗CD23抗体CD23 – PE） 单染色FITC标记的同型对照抗体匹配（在相同浓度的抗CD58抗体CD58 – FITC） 单染色PE – Cy5的标记的同型对照抗体匹配，以CD19 – PE – Cy5的（在相同浓度的抗CD19抗体） 三，与所有三个亚型对照抗体染色。 在黑暗中暂时储存在4 ° C的混合物。 在第三天后接触到EB病毒，轻轻漩涡容量瓶中，以获得更均匀的细胞悬液。卸下成2毫升Eppendorf管从烧瓶2毫升。自旋3分钟，在室温3000 RPM离心管。 流式细胞仪缓冲吸上清液和悬浮细胞，在5 × 10 6 1 × 10 7细胞/毫升。 删除8成单独的Eppendorf管50μL等分或96孔V型底板。旋管或盘在1500 × 克3分钟。 丢弃上清和涡管/板。每管中的悬浮细胞/孔50μL流式细胞仪4.2编写包含相应的抗体稀释缓冲。 就在30分钟的暗冰孵育管/板。在3分钟3000转离心细胞，取出上清液，加入200μL流式细胞仪缓冲。细胞再次离心，去除上清液完成洗。重复两个洗。 悬浮细胞在200μL，流式细胞仪缓冲和采集数据，使用流式细胞仪，获得20000事件/管。 使用WinMDI（流式细胞仪数据分析在PC免费）分析数据。门上使用正向和侧向散射配置的活细胞。然后，门活细胞表达CD19 +后与抗CD19抗体相匹配的同型对照抗体染色的细胞比较（B细胞标记）。剧情CD19 +生活乙Y轴X轴和CD58的荧光强度的细胞CD23的荧光强度。确定CD23 +和CD58 +细胞相匹配的同型对照抗体染色的细胞EB病毒暴露。 CD23 您好 CD58 +细胞（图2C）在EB病毒暴露的文化存在预测EB病毒感染的增长转化细胞的成功产物。相比之下，CD23 您好 CD58 +细胞不出现当细胞暴露于EB病毒（图2A）或接触到的EB病毒（图2B）非名垂千古的应变。 CD23 您好 CD58 +细胞已被实验证明经过扩散，并随后建立拼箱（14）。 5。扩建和冷冻保存的拼箱可视光镜细胞：由EB病毒感染后一周，光镜下可见细胞簇。图3显示了一个早期微观集群的烧瓶中（图3B）的例子。 随着时间的推移，微观集群成为较大等，团块可见宏观在烧瓶中。图3C建立拼箱细胞光镜显示更大的集群。 喂养细胞：双12日在培养瓶中的培养液量。随后，扩大其体积用增加2-3倍，使用完全RPMI文化。 喂养细胞周期的确定应基于细胞的生长速度。当培养基变成黄色，这是一般的时间，以取代上述媒体。通常情况下，发生这种情况，每周一次。然而，某些细胞株可能需要美联储或多或少频繁。在未来数周内展开文化75-100毫升。 超低温冷冻保存：当冷冻细胞，离心600 × 克细胞在室温下10分钟。冷冰寒含90％FBS的培养基和10％二甲基亚砜取出上清，重悬细胞沉淀在1 × 10 7细胞/毫升。将管在液氮中。 6。代表性的成果： 成功的结果是预测CD23 您好 CD58 +细胞的存在。大约2-3％的活细胞接触到EB病毒后3-4天，应该有此配置文件（图2C）。其他子群CD23 +，CD23 – ，CD58 +，和CD58 -细胞观察到EB病毒暴露后显示最小的扩散14。未感染的细胞（图2A）和暴露从HH514 – 16细胞（图2B），EB病毒窝藏非名垂千古的应变，EB病毒的细胞没有表现出CD23您好CD58 +细胞。 您也可以可视化细胞光镜监视成功的结果：正如前面提到的一个星期内，EB病毒感染后，烧瓶中的小群细胞是通过光镜（图3B）可见。随着时间的推移和细胞发展到拼箱，微观集群变大（图3C），团块肉眼可见烧瓶。 <p class ="“jove_content”"> 图1。淋巴细胞系的产生和冷冻保存的工作流程。外周血是通过聚蔗糖梯度离心。外周血单核细胞在一个既定的梯度巴菲大衣目前暴露FK506的EB病毒除了。在37 ° C在5％CO 2，建立和随后扩大为冻存拼箱存在EB病毒的细胞生长。 图2：一个预计接受暴露后，以EB病毒扩散的B细胞亚群的鉴定。联合国感染外周血单个核细胞（A）或外周血单核细胞暴露于EB病毒HH514 – 16细胞（B）或从B95 – 8细胞中存在的FK506（三）派生的第3天收获。细胞对CD19，CD23和CD58的荧光标记抗体染色。经过对活细胞的浇注S，未感染的（A）和EB病毒暴露（B和C），CD19 + B细胞CD23和CD58的表达研究。表达CD58和高水平的CD23（CD23 您好 CD58 +），B细胞的一个亚群指出，只有在细胞暴露改造主管EB病毒（B95 – 8细胞的），是描述。 图3。EB病毒感染细胞的细胞团的可视化。 PBMC中均采用FK506和与EB病毒感染。联合国感染（A）和EB病毒暴露（二）细胞研究的一个星期后感染相衬显微镜（10X放大倍率）。五老周淋巴母细胞线是在C