RNA Isolering av Pseudomonas aeruginosa Kolonisera Murine mag-tarmkanalen

1. Murina Modell av P. aeruginosa GI Colonization och spridning C3H/HeN möss (6-8 v. gammal, kvinna, Harlan) behandlas med perorala antibiotika för att tömma kommensala flora och därefter mono-koloniserad med PA som tidigare beskrivits 4. 2. Skörd Murine cecal luminala Innehåll Doppa en rengjord rostfritt stål murbruk i ett flytande kväve bad. Euthanize möss med koldioxid kvävning. Säkert musen kadaver på en frigolit ombord och dusch med 95% etanol. Gör en mittlinjen längsgående snitt genom huden från bröstbenet till mellangården. Reflektera hud och bukhinna avslöja bukhålan. Resect hela blindtarmen. Håll blindtarmen med pincett under den rostfria murbruk. Klippa båda ändarna av blindtarmen med dissektion sax. Sätt in en P1000 pipettspets fylld med 1 ml cecal flushate buffert (10 mM TrisHCl, 1 mM EDTA och 200 mM NaCl) 5 i proximala änden av blindtarmen. Spola cecal flushate buffert och cecal luminala innehållet i den rostfria murbruk. 1 ml cecal flushate buffert kommer att vara tillräcklig för att spola alla cecal innehåll. Cecal flushate innehållet fryser omedelbart efter att komma i kontakt med murbruk. Slipa cecal flushate innehåll med en steril mortelstöt. Placera marken frusen cecal luminala innehållet i ett 50 ml polypropylen koniska röret nedsänkt i en torr is / etanol bad. Upprepa steg 2.2 till 2.7 för varje ytterligare mus. Förvaras vid -80 ° C. 3. Bakteriell RNA Isolering Värm 1 volym (baserat på slutlig volym på två cecal luminala innehåll, ca 3 ml) av syra fenol / kloroform (5:1, v / v) i en 50 ml Oak Ridge centrifugrör med locket säkras i parafilm i en 65 ° C vattenbad. Koka 0,5 volym lyseringsbuffert (2% SDS, 16 mM EDTA och 200 mM NaCl) 6 finns i en 50 ml polypropylen koniska röret i 5 minuter. Tillsätt kokande lyseringsbuffert att cecal luminala innehåll. Homogenisera. Koka i 5 minuter med periodisk vortexa. Lägg till 100 ° C cecal Innehållet / lysering provet till 65 ° C syra fenol / kloroform i Oak Ridge centrifugrör. Seal keps med parafilm. Inkubera vid 65 ° C i 10 minuter med periodisk vortexa (varje 2 minuter). Centrifugera provet vid 2500 g vid 4 ° i 15 minuter. Töm vattenfasen (undviker någon av de vita gränssnittet) till ett nytt 50 ml Oak Ridge centrifugen. Volymen i vattenfasen kommer att vara cirka 50% av den totala volymen cecal innehåll, lyseringsbuffert och syra fenol / kloroform. Tillsätt en motsvarande volym av syra fenol / kloroform. Seal keps med parafilm och blanda väl genom att vortexa med hög hastighet. Centrifugera provet vid 2500 g vid 4 ° i 15 minuter. Upprepa steg från 3,7 till 3,9 tills det inte finns något synligt vitt gränssnitt mellan vattenfasen och den organiska fasen. Töm vattenfasen till en ny 50 ml Oak Ridge centrifugen. Tillsätt en motsvarande volym av kloroform / Isoamyl alkohol (24:1, v / v). Täta locket och blanda väl genom att vortexa. Centrifugera provet vid 2500 g vid 4 ° i 15 minuter. Ta bort vattenfasen (volymen kommer att vara cirka 50% av den totala reaktionen volym) till 15 ml polypropylen koniska rör och tillsätt en lika stor volym av isopropanol. Inkubera vid -20 ° i minst 2 timmar eller över natten. Centrifugera provet vid 2500 g vid 4 ° i 45 minuter. En gel-liknande pellets kommer att ligga på botten av röret. Avlägsna supernatanten. Tvätta pelleten med 1 ml iskall 70% etanol. Vortex. Centrifugera provet vid vid 10000 g vid 4 ° i 5 minuter. Avlägsna supernatanten och vänd röret att låta pellets torka i rumstemperatur i 10 minuter. Resuspendera RNA pelleten i 200 ìl RNase-fritt vatten. 4. DNas Behandling (Turbo DNA-Free, Applied Biosystems) Tillsätt 20 l 10X Turbo DNas buffert och 2 l Turbo DNas och blanda försiktigt. Inkubera vid 37 ° i 20 minuter. Tillsätt 20 l återsuspenderad DNas inaktivering reagens och blanda väl. Inkubera 5 minuter vid rumstemperatur, blandning ibland. Centrifugera vid 10000 g vid rumstemperatur i 1,5 minuter och överför supernatanten till ett nytt mikrofugrör. Lägg till en volym av kyla (4 °) syra fenol / kloroform och blanda väl genom att vortexa i 1 minut. Centrifugera vid 12.500 g vid rumstemperatur i 2 minuter. Överför vattenfasen till ett nytt rör och tillsätt 1 volym kloroform / Isoamyl alkohol (49:1 v / v), virvel. Centrifugera vid 12.500 g vid rumstemperatur i 2 minuter. Överför vattenfasen (ca 50% av den totala reaktionen volym) till ett nytt rör. Tillsätt 0,1 volym 3M natriumacetat, pH 5,5 och2,5 volymer av iskall 100% etanol. Vortex. Inkubera vid -20 ° i minst 2 timmar eller vid -80 ° i 30 minuter. Centrifugera vid 12 tusen g under 30 minuter vid 4 ° Avlägsna supernatanten. Tvätta pelleten med 1 ml iskall 70% etanol genom att centrifugera i 5 minuter vid 10000 g vid 4 °. Avlägsna supernatanten och lufttorka i 10 minuter. Återsuspendera pelleten i 100 ìl RNase-fritt vatten. Kan behöva ske i 65 ° vattenbad till resuspendera och lös pelleten. För att testa effekten av DNas behandling, kan en vanlig RT-PCR-reaktion för amplifiering av en ribosomala protein (eller annan referens gen) göras för behandlade och obehandlade prover, använder inga RT kontroller. 5. RNA Cleanup Steg (Qiagen, RNeasy Kit) Se sidorna 56-57 för Qiagen RNeasy Mini Handbook (4: e upplagan, april 2006). Följ som visas. 6. Representativa resultat Mängden bakterier totala RNA återvinns genom att använda det här protokollet är 2-3 mikrogram från två cecums. Den återvunna RNA är av tillräcklig kvantitet och kvalitet för senare qPCR, transkription profilering, och RNA Seq experiment. RNA renhet rutinmässigt utvärderas genom att mäta 260nm/280nm förhållandet 7 av provet, men den här metoden ger ingen information om RNA integritet. Den Agilent Bioanalyzer är en mikrofluidik-baserad plattform för dimensionering, kvantifiering och kvalitetskontroll av DNA, RNA, proteiner och celler, och använder en RNA integriteten metriska kallas RNA Integrity Number (RIN) 8. RNA extraheras med detta protokoll ger 260/280 nyckeltal som sträcker sig från 1,7 till 2,0 och RIN värden ≥ 7,0. Ett exempel på en Agilent Bioanalyzer analys av bakteriell RNA återvinnas genom detta protokoll visas i figur 1. Figur 1. Agilent Bioanalyzer electropherogram och gel-liknande bild av Pseudomonas aeruginosa totala RNA-prov isolerade och återhämtat sig från murina cecal innehåll. RIN 8,0.