РНК Выделение Синегнойной палочки Колонизация мышей Желудочно-кишечный тракт
Summary
Надежный метод для выделения РНК<em> Синегнойной палочки</em> Оправился от мышиной cecums описано. РНК найдены, в достаточном количестве и надлежащего качества для последующего КПЦР, транскрипция профилирования и РНК Seq экспериментов. Эта техника может быть адаптирована для РНК изоляции других кишечных микробов.
Abstract
Синегнойной палочки (PA) инфекции приводят к значительной заболеваемости и смертности у хозяев с ослабленной иммунной системой, например, больных лейкозом, тяжелых ожоговых ран, или трансплантации органов 1. У пациентов с высоким риском развития инфекций ПА крови, желудочно-кишечного тракта (ЖКТ) является основным резервуаром для колонизации 2, но механизмы, посредством которых ПА переходы от бессимптомной колонизации микроба к инвазивным, и часто смертельно, возбудитель не ясны. Ранее мы провели в естественных условиях эксперименты профилирования транскрипции путем восстановления ПА мРНК из клеток бактерий, проживающих в cecums колонизированных мышей 3 с целью выявления изменений в бактериальной экспрессии генов в процессе изменений в иммунном статусе хозяина.
Как и в любом эксперименте профилирования транскрипции, ограничение скорости шаг в изоляции достаточного количества мРНК высоким качеством. Учитывая обилие ферментов, мусора, остатков пищи, а также твердых частиц в желудочно-кишечном тракте, задача выделения РНК, устрашает. Здесь мы представляем метод надежных и воспроизводимых изоляции бактериальных РНК оправился от мышиной желудочно-кишечного тракта. Этот метод использует устоявшихся мышиной модели РА Г. И. колонизации и нейтропения вызванной распространением 4. Как только Г. И. колонизации с П. А. подтвердится, мышей эвтаназии и слепой кишки содержимое выздоровел и глубокой заморозки. РНК затем извлекали с помощью комбинации механического разрушения, кипения, фенол / хлороформ удаление зубов, ДНКазы лечения и аффинной хроматографии. Количество и чистота подтверждаются спектрофотометрии (Nanodrop технологий) и bioanalyzer (Agilent Technologies) (рис. 1). Этот метод Г. И. изоляции микробной РНК могут быть легко адаптированы для других бактерий и грибов, а также.
Protocol
Discussion
Метод выделения РНК, описанные здесь допускает восстановление достаточного количества высококачественных синегнойной палочки общей РНК найденным на мышиных желудочно-кишечного тракта. Этот метод не ограничивается П. палочки и потенциально могут быть применены к другим бактериям. Восстановление достаточного организмов микробной из кишечника будет значительно отличаться от организма к организму. В нашей мышиной модели, П. палочки обычно колонизирует мышиной желудочно-кишечного тракта на уровне от 5 х 10 7 до 5 х 10 8 КОЕ / г кала 4. После восстановления содержимого слепой кишки примерно 0,5 грамма, оценочное число P. палочки восстановленные из двух cecums составляет от 5 х 10 7 до 5 х 10 8 КОЕ. Если других микроорганизмов используются, было бы благоразумно проверить И. уровня колонизации, а затем подсчитать количество cecums необходимые для восстановления целевых число КОЕ. Важно также отметить, что при использовании этой мышиной модели частности, антибиотиков мышей, не инфицированных ПА не имеют значительных количествах из РНК, выделенной из слепой кишки их содержание.
Наши мышиной модели синегнойной палочки желудочно-кишечного колонизации и распространению попытки подражать патогенезе П. палочки бактериемии у онкологических пациентов и стволовых клетка трансплантации. В этой популяции пациентов, синантропных флоры часто обедненного вторичной по отношению к антибиотикам или химиотерапевтического лечения (например, антибиотиков истощение И. синантропных флоры), в результате чрезмерно быстрый рост патогенных микробов (например, моно-ассоциации с P. палочки), а затем последующее распространение после иммуносупрессии. Преимущества и недостатки этой мышиной модели уже были рассмотрены ранее 4. Цель этого текущего исследования является предоставление методологии выделения микробной общей РНК из желудочно-кишечного тракта. Этот протокол может быть легко адаптированы для других мышиных моделях, что изучение других аспектов микробного патогенеза в желудочно-кишечном тракте (т.е. синантропных флоры взаимодействий, бактериальные воздействие на воспалительные заболевания кишечника и др.).
Одним из преимуществ этого метода является включение нескольких шагов лизиса в том числе замораживания / оттаивания, механическое разрушение (распыление с раствором / пестиком, гомогенизации), кипячение и химическая лизиса (например, SDS). Несмотря на множество лизис шаги, некоторые микроорганизмы (в частности, грам-положительных бактерий и грибов / дрожжи) может потребоваться дополнительное механическое разрушение. После горячей лизиса / кислота фенол-хлороформ инкубации (шаг 3.5), помимо бус (0,1 мм для бактерий и / или 0,5-0,7 мм для дрожжей) и последующее бусинка избиение шаг должен быть достаточным, чтобы лизировать эти организмы 9, 10.
Учитывая сложный характер материалы, извлеченные из мышиных слепой кишки, повторяется холодной экстракции acid-phenol/chloroform (шаг 3,7 до 3,9) совершенно необходимы для достижения приемлемого качества РНК и целостность далее вниз по течению реакции. В период 3-5 холодной экстракции acid-phenol/chloroform может потребоваться до белого интерфейс между водной и органической фаз исключается. Наконец, сочетание лечения ДНКазы (Шаг 4) и RNeasy протокол Cleanup (шаг 5) необходимы для удаления загрязнения ДНК и малых не-мРНК (5с и тРНК). Как указывалось ранее, РНК восстановленные с использованием этого протокола в достаточном количестве и надлежащего качества для последующего профилирования транскрипции 3, КПЦР (не опубликовано), и РНК Seq (не опубликовано) экспериментов.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа финансировалась Национальным институтом здоровья гранты AI62983 (АЙК), AI22535 (ГПБ).
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number |
|---|---|---|
| Mortar and Pestle | Fisher | 12-947-1 |
| Homogenizer | Omni | TM-125 |
| Oak Ridge centrifuge tubes (50 ml) | Nalgene | 3119-0050 |
| Acid Phenol/Chloroform | Ambion | AM9720 |
| Chloroform | Sigma-Aldrich | C2432 |
| Isoamyl Alcohol | Sigma-Aldrich | W205702 |
| Isopropanol | Sigma-Aldrich | 190764 |
| Diethyl pyrocarbonate (DEPC) | Sigma-Aldrich | 40718 |
| DNase | Ambion | AM2238 |
| RNeasy Kit | Qiagen | 74104 |
| 3M Sodium Acetate | Ambion | AM9740 |
| 100% Ethanol | Sigma-Aldrich | E7023 |
References
- Bodey, G. P., Bolivar, R., Fainstein, V., Jadeja, L. Infections caused by Pseudomonas aeruginosa. Rev Infect Dis. 5, 279-279 (1983).
- Bertrand, X. Endemicity, molecular diversity and colonisation routes of Pseudomonas aeruginosa in intensive care units. Intensive Care Med. 27, 1263-1268 (2001).
- Koh, A. Y. Utility of in vivo transcription profiling for identifying Pseudomonas aeruginosa genes needed for gastrointestinal colonization and dissemination. PLoS One. 5, e15131-e15131 (2010).
- Koh, A. Y., Priebe, G. P., Pier, G. B. Virulence of Pseudomonas aeruginosa in a murine model of gastrointestinal colonization and dissemination in neutropenia. Infect Immun. 73, 2262-2272 (2005).
- Alexander, R. J., Raicht, R. F. Purification of total RNA from human stool samples. Dig Dis Sci. 43, 2652-2658 (1998).
- Fitzsimons, N. A., Akkermans, A. D., de Vos, W. M., Vaughan, E. E. Bacterial gene expression detected in human faeces by reverse transcription-PCR. J Microbiol Methods. 55, 133-140 (2003).
- Manchester, K. L. Use of UV methods for measurement of protein and nucleic acid concentrations. Biotechniques. 20, 968-970 (1996).
- Schroeder, A. The RIN: an RNA integrity number for assigning integrity values to RNA measurements. BMC Mol Biol. 7, 3-3 (2006).
- Turnbaugh, P. J. A core gut microbiome in obese and lean twins. Nature. 457, 480-484 (2009).
