Isolamento del RNA Pseudomonas aeruginosa Colonizzare la Murine tratto gastrointestinale
Summary
Un metodo affidabile per l'isolamento di RNA<em> Pseudomonas aeruginosa</em> Recuperato da cecums murino è descritto. L'RNA recuperato è di quantità e qualità sufficienti per qPCR successivi, profili di trascrizione, e l'RNA esperimenti Seq. Questa tecnica può essere adattata per l'isolamento di RNA di altri microbi intestinali.
Abstract
Pseudomonas aeruginosa (PA) causa infezioni in significativa morbidità e mortalità in host con sistema immunitario compromesso, come i pazienti affetti da leucemia, gravi ustioni, o trapianti di organi 1. Nei pazienti ad alto rischio di sviluppare infezioni del sangue PA, il tratto gastrointestinale (GI) è il principale serbatoio per la colonizzazione 2, ma i meccanismi con cui transizioni PA da un microbo ad una colonizzazione asintomatica invasiva, e spesso mortale, patogeno non sono chiare. In precedenza, abbiamo effettuato esperimenti in vivo profilazione trascrizione mRNA PA attraverso il recupero di cellule batteriche residenti nel cecums di topi colonizzati 3, per identificare i cambiamenti nell'espressione genica batterica durante alterazioni dello stato immunitario dell'ospite.
Come con qualsiasi esperimento profilazione trascrizione, il fattore limitante è l'isolamento di una sufficiente quantità di mRNA di alta qualità. Data l'abbondanza di enzimi, detriti, residui di cibo, e particolato nel tratto gastrointestinale, la sfida di isolamento dell'RNA è scoraggiante. Qui, vi presentiamo un metodo per l'isolamento affidabile e riproducibile di RNA batterico recuperato dal tratto GI murino. Questo metodo utilizza un consolidato modello murino di colonizzazione PA GI e neutropenia indotta dalla diffusione 4. Colonizzazione volta GI con PA è confermata, i topi sono contenuti eutanasia e del cieco vengono recuperati e flash congelati. L'RNA viene poi estratta usando una combinazione di distruzione meccanica, bollitura, fenolo / cloroformio estrazioni, trattamento DNase, e cromatografia di affinità. Quantità e la purezza sono confermati da spettrofotometria (Tecnologie NanoDrop) e Bioanalyzer (Agilent Technologies) (Fig. 1). Questo metodo di isolamento microbico GI RNA può essere facilmente adattato ad altri batteri e funghi, come pure.
Protocol
Discussion
Il metodo di estrazione di RNA qui descritto consente il recupero di una quantità sufficiente di alta qualità RNA totale Pseudomonas aeruginosa raccolte dal tratto GI murino. Questo metodo non si limita a P. aeruginosa e possono potenzialmente essere applicato ad altri batteri. Il recupero di organismi microbici sufficiente da parte dell'intestino varia significativamente da un organismo all'altro. Nel nostro modello murino, P. aeruginosa tipicamente colonizza il tratto gastrointestinale murino a livelli tra 5 x 10 7 a 5 x 10 8 CFU / g feci 4. Dal momento che il contenuto recuperato del cieco sono circa 0,5 grammi, il numero stimato di P. aeruginosa recuperato da due cecums è compresa tra 5 x 10 7 a 5 x 10 8 cfu. Se altri microrganismi vengono utilizzati, sarebbe prudente per verificare i livelli di colonizzazione GI e quindi calcolare il numero di cecums necessari per recuperare il numero mirato di cfu. E 'anche importante notare che quando si utilizza questo particolare modello murino, topi trattati con antibiotico non infettati con PA non quantificabile quantità di RNA isolati dal loro contenuto cecale.
Il nostro modello murino di colonizzazione Pseudomonas aeruginosa gastrointestinale e tentativi di diffusione di emulare la patogenesi di P. aeruginosa batteriemia nel cancro e pazienti sottoposti a trapianto di cellule staminali. In questa popolazione di pazienti, la flora commensale è spesso impoverito secondaria al trattamento con antibiotici o chemioterapici (ad esempio l'esaurimento antibiotico di GI flora commensale) con conseguente proliferazione di microbi patogeni (ad esempio mono-associazione con P. aeruginosa) e successiva diffusione, dopo la soppressione immunitaria. I vantaggi ei limiti di questo modello murino sono già stati affrontati in precedenza 4. Lo scopo di questo studio è di fornire una metodologia per isolare microbica RNA totale dal tratto GI. Questo protocollo può essere facilmente adattato ad altri modelli murini che lo studio di altri aspetti della patogenesi microbica nel tratto gastrointestinale (per esempio la flora commensale interazioni, effetti batterica sulle malattie infiammatorie intestinali, ecc.)
Un vantaggio di questo metodo è l'incorporazione di passi lisi multiple compreso gelo / disgelo, distruzione meccanica (polverizzando con malta / pestello, omogeneizzazione), bollitura, e lisi chimica (per esempio, SDS). Nonostante la moltitudine di passi lisi, alcuni microrganismi (in particolare batteri Gram-positivi e funghi / lievito) possono richiedere ulteriori rottura meccanica. Dopo il caldo lisi / acido fenolo-cloroformio incubazione (Step 3.5), l'aggiunta di perline (0,1 mm per i batteri e / o di 0,5-0,7 mm per lievito) e una successiva perline battendo passo dovrebbe essere sufficiente per lisare questi organismi 9, 10.
Data la natura complessa del materiale recuperato dal topo cieco, le ripetute freddo estrazioni acid-phenol/chloroform (Passo 3,7-3,9) sono assolutamente necessari per ottenere qualità accettabile RNA e l'integrità per ulteriori reazioni a valle. Tra i 3-5 freddo estrazioni acid-phenol/chloroform può essere richiesto prima che l'interfaccia bianca tra le fasi acquosa e organica è eliminata. Infine, la combinazione di entrambi i trattamenti DNasi (punto 4) e il protocollo di pulizia RNeasy (Fase 5) sono essenziali per la rimozione del DNA contaminante e piccoli non-mRNA (5s e tRNA). Come affermato in precedenza, l'RNA recuperato utilizzando questo protocollo è di quantità e qualità sufficienti per il profiling di trascrizione successivi 3, qPCR (inedito), e RNA Seq (inedito) esperimenti.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è stato finanziato dal National Institutes of Health concede AI62983 (ayk), AI22535 (GPB).
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number |
|---|---|---|
| Mortar and Pestle | Fisher | 12-947-1 |
| Homogenizer | Omni | TM-125 |
| Oak Ridge centrifuge tubes (50 ml) | Nalgene | 3119-0050 |
| Acid Phenol/Chloroform | Ambion | AM9720 |
| Chloroform | Sigma-Aldrich | C2432 |
| Isoamyl Alcohol | Sigma-Aldrich | W205702 |
| Isopropanol | Sigma-Aldrich | 190764 |
| Diethyl pyrocarbonate (DEPC) | Sigma-Aldrich | 40718 |
| DNase | Ambion | AM2238 |
| RNeasy Kit | Qiagen | 74104 |
| 3M Sodium Acetate | Ambion | AM9740 |
| 100% Ethanol | Sigma-Aldrich | E7023 |
References
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