RNA בידוד Pseudomonas aeruginosa מיישבים את מערכת העיכול Murine

1. דגם Murine של פ GI aeruginosa להתיישבות והפצת עכברים C3H/HeN (6-8 wks הישן, נקבה, הרלן) מטופלים עם אנטיביוטיקה דרך הפה כדי לרוקן צומח commensal ולאחר מכן מונו יישבו עם הרשות הפלסטינית כפי שתואר לעיל 4. 2. מסיק Murine תוכן לומינל Cecal לטבול מרגמה לנקות נירוסטה לתוך אמבט חנקן נוזלי. להרדים עכברים בחנק פחמן דו חמצני. עכבר פגר מאובטחת על לוח קלקר ומקלחת עם אתנול 95%. לעשות חתך אורכי קו האמצע דרך העור מעצם החזה ועד חיץ הנקבים. לשקף את העור הצפק לחשוף את חלל הבטן. לכרות cecum כולו. החזק את cecum עם מלקחיים מעל המכתש נירוסטה. Snip בשני הקצוות של cecum עם מספריים לנתיחה. הכנס קצה פיפטה P1000 מלא מ"ל 1 של חיץ flushate cecal (10 mM TrisHCl, 1 mM EDTA ו – 200 mM NaCl) 5 אל הקצה הפרוקסימלי של cecum. פלאש החיץ flushate cecal ותכנים luminal cecal אל תוך המדוכה נירוסטה. 1 מ"ל של חיץ flushate cecal יהיה מספיק הסמקה כל תוכן cecal. Cecal תוכן flushate יהיה להקפיא מיד לבוא במגע עם מרגמה. טוחנים את תוכן flushate cecal עם העלי סטרילית. הקרקע מקום קפוא תוכן luminal cecal לתוך צינור פוליפרופילן 50 מ"ל חרוטי שקוע באמבט קרח / אתנול יבש. חזור על שלבים 2.2 עד 2.7 עבור כל עכבר נוסף. חנות ב -80 ° C. 3. בידוד חיידקי RNA נפח חם 1 (בהתבסס על נפח סופי של שני תוכן luminal cecal, כ 3 מ"ל) של חומצת פנול / כלורופורם (05:01, v / v) הנכלל שפופרת 50 מ"ל Oak Ridge צנטריפוגה עם כובע מאובטחת parafilm ב 65 ° C אמבט מים. מרתיחים 0.5 נפח המאגר תמוגה (2% SDS, 16 mM EDTA ו – 200 mM NaCl) 6 הכלולים צינור פוליפרופילן 50 מ"ל חרוטי במשך 5 דקות. הוסף חוצץ תמוגה רותחים לתכנים luminal cecal. Homogenize. מרתיחים במשך 5 דקות עם vortexing תקופתיות. מוסיפים את 100 ° C תוכן cecal / מדגם תמוגה על חומצה 65 מעלות צלזיוס פנול / כלורופורם את הצינור צנטריפוגות רידג'. חותם כובע עם parafilm. לדגור על 65 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות עם vortexing תקופתיים (כל 2 דקות). צנטריפוגה מדגם ב g 2500 ב · 4 במשך 15 דקות. בזהירות העברת השלב מימית (הימנעות מכל של הממשק לבן) כדי צנטריפוגה רידג' Oak טרי 50 מ"ל. היקף השלב מימית תהיה כ -50% מהנפח הכולל של תוכן cecal, חיץ תמוגה, וחומצה פנול / כלורופורם. הוסף נפח שווה של חומצת פנול / כלורופורם. חותם כובע עם parafilm ומערבבים היטב על ידי vortexing במהירות גבוהה. צנטריפוגה מדגם ב g 2500 ב · 4 במשך 15 דקות. חזור על שלבים 3.7-3.9 עד אין ממשק לבן גלוי בין שלבי מימית ואורגנית. בזהירות כדי להעביר את השלב מימית צנטריפוגה רידג' Oak טרי 50 מ"ל. הוסף נפח שווה של כלורופורם / isoamyl אלכוהול (24:1, v / v). חותם כובע ומערבבים היטב על ידי vortexing. צנטריפוגה מדגם ב g 2500 ב · 4 במשך 15 דקות. הסר השלב מימית (נפח יעמוד על כ 50% מנפח את התגובה בסה"כ) כדי שפופרת 15 מ"ל פוליפרופילן חרוטי ולהוסיף נפח שווה של isopropanol. דגירה ב -20 ° לפחות 2 שעות או למשך הלילה. צנטריפוגה מדגם ב g 2500 · 4 ב 45 דקות. ג'ל כמו גלולה יהוו בחלק התחתון של הצינור. הסר supernatant. שטפו את הכדור עם 1 מ"ל של אתנול קר כקרח 70%. וורטקס. צנטריפוגה מדגם ב ב ז ב 10,000 · 4 במשך 5 דקות. הסר את supernatant ו להפוך את הצינור כדי לאפשר יבש גלולה בטמפרטורת החדר למשך 10 דקות. Resuspend גלולה רנ"א 200 μl מים RNase חינם. 4. DNase טיפול (Turbo-DNA חינם, Applied Biosystems) הוסף 20 μl של חיץ 10X DNase טורבו 2 μl טורבו DNase ומערבבים בעדינות. לדגור על ° 37 במשך 20 דקות. הוסף 20 μl של מגיב DNase resuspended איון ומערבבים היטב. דגירה 5 דקות בטמפרטורת החדר, ערבוב מדי פעם. צנטריפוגה ב g 10,000 בטמפרטורת החדר למשך 1.5 דקות ולהעביר את supernatant לצינור microfuge חדש. הוסף כרך אחד של חומצה (4 מעלות) קר פנול / כלורופורם ומערבבים היטב על ידי vortexing דקה 1. צנטריפוגה ב g 12,500 בטמפרטורת החדר למשך 2 דקות. מעבירים את השלב מימית לצינור חדשה ולהוסיף 1 נפח של כלורופורם / isoamyl אלכוהול (49:1 v / v), מערבולת. צנטריפוגה ב g 12,500 בטמפרטורת החדר למשך 2 דקות. מעבירים את השלב מימית (כ 50% מנפח את התגובה סה"כ) לצינור חדש. הוסף נפח של 0.1 נתרן אצטט 3M, ו-pH 5.52.5 כרכים של אתנול קר כקרח 100%. וורטקס. דגירה ב -20 ° לפחות 2 שעות או ב -80 ° במשך 30 דקות. צנטריפוגה ב g 12,000 במשך 30 דקות ב 4 מעלות הסר supernatant. שטפו את הכדור עם 1 מ"ל של אתנול קר כקרח 70% על ידי centrifuging במשך 5 דקות ב g 10,000 ב · 4. הסר את supernatant יבשה ואוויר במשך 10 דקות. Resuspend גלולה ב 100 μl מים RNase חינם. במאי צריך לשים באמבט מים 65 ° עד resuspend ו לפזר את גלולה. כדי לבדוק את היעילות של הטיפול DNase, בתגובה RT-PCR תקן הגברה של חלבון ריבוזומלי (או גן התייחסות אחרת) יכול להתבצע עבור דגימות מטופלים ולא מטופלים, תוך שימוש לא שולטת RT. 5. RNA שלב ניקוי (Qiagen, RNeasy Kit) עיינו בדפי 56-57 של Qiagen RNeasy מיני מדריך (4 th Edition, אפריל 2006). פעל כפי שצוין. 6. נציג תוצאות הסכום הכולל של RNA חיידקי התאושש באמצעות פרוטוקול זה הוא כ 2-3 מיקרוגרם משני cecums. RNA התאושש היא בכמות ובאיכות מספקת עבור qPCR הבאים, פרופיל שעתוק, ו-RNA ניסויים Seq. טוהר RNA נבחנת באופן שוטף על ידי מדידת יחס 260nm/280nm 7 המדגם, אך שיטה זו אינה מספקת מידע על תקינות RNA. Bioanalyzer Agilent היא פלטפורמה מיקרופלואידיקה מבוסס על כימות, אומדת ובקרת איכות של DNA, RNA, חלבונים בתאים וכן מנצל מטרי שלמות המכונה RNA מספר Integrity RNA (רין) 8. RNA חילוץ עם פרוטוקול זה מייצר 260/280 יחסי החל 1.7-2.0 וערכים רין ≥ 7.0. דוגמה לניתוח Agilent Bioanalyzer של RNA חיידקי התאושש על ידי פרוטוקול זה מוצג באיור 1. באיור 1. Agilent Bioanalyzer electropherogram וג'ל כמו התמונה של מסך מדגם Pseudomonas aeruginosa RNA בודד התאושש תוכן cecal Murine. רין 8.0.