ПЦР-метод генотипирования различать дикого типа и декоративных многообразия Императы цилиндрической</em
Summary
Мы предоставляем экономически эффективного и быстрого молекулярного генотипирования протокол, который использует различные конкретные ПЦР-праймеры, что целевой последовательности ДНК, различия внутри хлоропласта trnL-F Spacer региона различать сорта<em> Императы цилиндрической</em> (Cogongrass), которые не могут быть выделены только по морфологии. Эти сорта включают федерального значения вредных сорняков, cogongrass и тесно связанных, в широком распространении различных декоративных, я<em>. cylindrica</em> Обл.<em> Koenigii</em> (Японская трава крови).
Abstract
Wild-type I. cylindrica (cogongrass) is one of the top ten worst invasive plants in the world, negatively impacting agricultural and natural resources in 73 different countries throughout Africa, Asia, Europe, New Zealand, Oceania and the Americas1-2. Cogongrass forms rapidly-spreading, monodominant stands that displace a large variety of native plant species and in turn threaten the native animals that depend on the displaced native plant species for forage and shelter. To add to the problem, an ornamental variety [I. cylindrica var. koenigii (Retzius)] is widely marketed under the names of Imperata cylindrica ‘Rubra’, Red Baron, and Japanese blood grass (JBG). This variety is putatively sterile and noninvasive and is considered a desirable ornamental for its red-colored leaves. However, under the correct conditions, JBG can produce viable seed (Carol Holko, 2009 personal communication) and can revert to a green invasive form that is often indistinguishable from cogongrass as it takes on the distinguishing characteristics of the wild-type invasive variety4 (Figure 1). This makes identification using morphology a difficult task even for well-trained plant taxonomists. Reversion of JBG to an aggressive green phenotype is also not a rare occurrence. Using sequence comparisons of coding and variable regions in both nuclear and chloroplast DNA, we have confirmed that JBG has reverted to the green invasive within the states of Maryland, South Carolina, and Missouri. JBG has been sold and planted in just about every state in the continental U.S. where there is not an active cogongrass infestation. The extent of the revert problem in not well understood because reverted plants are undocumented and often destroyed.
Application of this molecular protocol provides a method to identify JBG reverts and can help keep these varieties from co-occurring and possibly hybridizing. Cogongrass is an obligate outcrosser and, when crossed with a different genotype, can produce viable wind-dispersed seeds that spread cogongrass over wide distances5-7. JBG has a slightly different genotype than cogongrass and may be able to form viable hybrids with cogongrass. To add to the problem, JBG is more cold and shade tolerant than cogongrass8-10, and gene flow between these two varieties is likely to generate hybrids that are more aggressive, shade tolerant, and cold hardy than wild-type cogongrass. While wild-type cogongrass currently infests over 490 million hectares worldwide, in the Southeast U.S. it infests over 500,000 hectares and is capable of occupying most of the U.S. as it rapidly spreads northward due to its broad niche and geographic potential3,7,11. The potential of a genetic crossing is a serious concern for the USDA-APHIS Federal Noxious Week Program. Currently, the USDA-APHIS prohibits JBG in states where there are major cogongrass infestations (e.g., Florida, Alabama, Mississippi). However, preventing the two varieties from combining can prove more difficult as cogongrass and JBG expand their distributions. Furthermore, the distribution of the JBG revert is currently unknown and without the ability to identify these varieties through morphology, some cogongrass infestations may be the result of JBG reverts. Unfortunately, current molecular methods of identification typically rely on AFLP (Amplified Fragment Length Polymorphisms) and DNA sequencing, both of which are time consuming and costly. Here, we present the first cost-effective and reliable PCR-based molecular genotyping method to accurately distinguish between cogongrass and JBG revert.
Protocol
Discussion
Питомник США и пейзаж промышленности процветать на выращивании и продаже экзотических и новых видов растений. Это, в сочетании с растущей глобализацией торговли, увеличивает вероятность того, что инвазивных видов растений войдет, создание и распространение в США, возможность регулирования федерального таких растений основывается на информации, которая зачастую отсутствует, в том числе могут стать инвазивными , правильный таксономии, и генетические отличия от родных и натурализованный таксонов. Потому что наши знания о инвазивных растений часто ограничены, импортные растения со скрытыми инвазивные характеристики были добровольно введены только узнать позже, что они вторгаются в нашу сельского хозяйства и природных ресурсов. Этот протокол направлен на решение таких проблем, связанных с I. cylindrica сортов, обеспечивая первый упрощенный молекулярный метод, который может точно различать дикого типа cogongrass и вернулась форма его коллега декоративных JBG.
jove_content "> Для развития этого протокола, дикого типа cogongrass была собрана из натурализованных населения на пруду Крик лесной группы в округе Санта-Роза у Джея, штат Флорида, в июне 2008 года. JBG было закуплено из коммерческих питомников (Bluebird Детский сад, Inc ..) в июне 2008 года, а также из собрания домовладельцев в Колумбии, штат Миссури JBG возвращается были получены из двора Кэмпбелл Геологический музей в Clemson University, штат Южная Каролина в июне 2008 года, из University Park в Riverdale, MA в июне 2009 года, и с передней дворе домовладельцев в Колумбии, штат Миссури в 2009 году (определенных Леланд Cseke). Все растения были сохранены в теплице находится в университете штата Алабама в Хантсвилле (Huntsville, AL).Генетическое секвенирование ДНК, собранных из этих растений, занесенных в глубине сравнения 9 независимых областей ДНК широко используется для штрих-кода растений 2. Во всех случаях, последовательности JBG были 100% бонус до тех JBG вернуться, тем самым помогаяубедиться, что JBG действительно вернуться к зеленым, инвазивные формы. Только ядерный ЕЕ и хлоропластов trnL-F регионах различия, которые могут быть использованы для генетически различия между cogongrass и JBG. Регион ЕГО имеет в общей сложности 3 ОНП (единичные нуклеотидные полиморфизмы) между cogongrass и JBG, а trnL-F регион имеет 2 ОНП и 2 индели (вставка и удаление). Эти генетические различия позволили эстрадно-ПЦР праймеры, которые будут разработаны, что может отличить дикого типа cogongrass и JBG возвращается. Наиболее надежные результаты пришли из праймеров происходит от пластид trnL-F региона. Таким образом, этот протокол на основе последовательности различия между trnL-F регионов геном хлоропластов cogongrass, JBG и вернулся JBG (рис. 4).
Для создания грунтовки, более характерные для сорта идет речь, и, чтобы избежать ложных срабатываний от близкородственных видов, др.л известно trnL-F последовательности I. cylindrica сорта по сравнению с trnL-F последовательностей из родственных видов трав (43 независимых последовательностей из 29 видов, например, Cymbopogon citratus, Sorghastrum incompletum, Coix Lacryma-Jobi, Miscanthus Sinensis, сахар officinarum, сорго halepense). Хотя, мы рассмотрели различные конкретные первичной последовательности через 29 видов трав, специфику эстрадно-специфических праймеров не был всесторонне рассмотрен на его способность усиливать ДНК от большинства других видов трав. Таким образом, ткани, используемые для экстракции ДНК должны быть тщательно определены, как и я cylindrica до начала этого протокола. Если трава не могут быть определены либо как cogongrass или JBG, то мы предлагаем секвенирование ПЦР-продукта, чтобы убедиться, что последовательности точно соответствует cogongrass или JBG. В настоящее время наиболее точный метод для проверки подлинности данного трава образец для выполнения ПЦР и на тРНБ-F и ее регионов, а затем последовательность проверки продуктов ПЦР и сравнения последовательностей известных последовательностей точно определить таксонов. ДНК может быть усилен контроль использования праймеров, описанных в этом протоколе (для trnL-F области) или других праймеров, которые доступны в других публикациях 13-15. Последовательность гораздо больше труда и дорогостоящие, чем при использовании нашей упрощенной процедуре.
Качество праймеров для ПЦР имеет решающее значение для успеха процедуры. Мы сделали грунтовки для этой процедуры можно получить Oblique Bio, Inc ( http://www.obliquebio.com/web/ , Хантсвилле, Алабама). Преимущество заказа праймеров из Oblique Bio является то, что они хранят большое количество порции каждого праймера с одинаковым серийное производство образца праймеров мы использовали для оптимизации в нашей лаборатории. Следовательно, грунтовки не только в той же последовательности, но тэй приходят с того же серийного производства, которая была использована в данном протоколе. Использование праймера от той же партии, может помочь избежать посторонних переменных в процедуре, которая может быть следствием различий в качестве праймеров ПЦР. Кроме того, в то время как другие полимеразы Taq должно работать нормально для ПЦР, качество Taq полимеразы использовать окажет влияние на качество результатов ПЦР. Для обеспечения лучшей согласованности в ПЦР реагентов, мы оптимизировали протокол с использованием реагентов из Clontech. Преимущество 2 полимеразы (Clontech, Mountain View, CA, Cat # 639201 или 639202) представляет собой смесь из надежных, горячего старта Taq-полимеразы и корректура фермент, который помогает обеспечить высокую специфичность и более точные уточнениями.
Поскольку этот протокол основывается на хлоропластов ДНК, которая наследуется по материнской линии в травах, гибридизация между событиями cogongrass и JBG генотипов не могут быть захвачены с нашими молекулярно процедуру идентификации. В случаях, когда это hypridization suspeИДКТК, мы рекомендуем использовать ядерное регионов, которые наследуются от обоих родителей. Наиболее часто используемые, не пластид переменная региона рассмотреть на заводе генотипирования является ядерной рибосомальной регионе ЕЕ 13-15,17. В настоящее время мы добиваемся прогресса в направлении усиления мультиплексирования хлоропласта trnL-F региона с ядерной области ИТС в то же ПЦР-пробирку. Мультиплексирование пластид с ядерной области ДНК потенциально обойти ограничения использования как в одиночку, однако, такие методы требуют оптимизации и дополнительной оценки с целью определения возможности в каждом конкретном случае. Использование количественного ПЦР в реальном времени (КПЦР) и новых технологий, таких как молекулярные маячки (флуоресцентных зондов грунтовка), также оценивается как аварийные и точные методы генотипирования растений.
Протокол, представленные здесь обеспечивает быстрый и надежный способ отличить JBG вернуться из этого дикого cogongrass. Мы рекомендуем использоватьRS этого протокола связаться с нами, чтобы сообщить результаты, полученные с использованием этого протокола. Такой обмен информацией поможет предоставить информацию о распределении JBG возвращается. Это также поможет регуляторов USDA принимать обоснованные решения о действиях, которые могут быть нужны, чтобы обойти распространения и потенциального гибридизации сортов высоко инвазивный cogongrass.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Мы благодарим Алана Tasker (USDA-ТЛЯ, Riverdale, MD), Стивен Комптон (Clemson), Шерри Aultman (Clemson), Крейг Рэмси (USDA-ТЛЯ, Fort Collins, CO), и Бетти Marose (UMD) за помощь в получении образцов . Мы благодарим студентов Эндрю Адриан (UA-Хантсвилле) и Дерек Такер (UA-Хантсвилл) за помощь в тестировании этот протокол, и Иосиф Herdy за его работу в съемках видео. Эта работа финансировалась Национальным рыбного и охотничьего фонда.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
| DNeasy Plant Mini Kit | Qiagen, Valencia, CA | 69104 or 69106 | Any reputable genomic plant DNA kit that yields good quality DNA should work fine for these procedures. |
| trnF(GAA)-F | Oblique Bio, Inc. | 3-0578 | Forward positive control primer |
| trnL(5′ exon)-C | Oblique Bio, Inc. | 3-0579 | Reverse positive control primer |
| trnLF-C-F1 | Oblique Bio, Inc. | 3-0864 | Forward wild-type cogongrass primer |
| trnLF-C-R1 | Oblique Bio, Inc. | 3-0865 | Reverse wild-type cogongrass primer |
| trnLF-R-F2 | Oblique Bio, Inc. | 3-0866 | Forward JBG and JBG revert primer |
| trnLF-R-R2 | Oblique Bio, Inc. | 3-0867 | Reverse JBG and JBG revert primer |
| Advantage UltraPure PCR dNTP Mix | Clontech, Mountain View, CA | 639125 | |
| Advantage 2 Polymerase | Clontech, Mountain View, CA | 639201 or 639202 | A good proof-reading, hot-start Taq polymerase |
References
- Holm, L. G., Pancho, J. V., Herberger, J. P., Plucknett, D. L. . A Geographical Atlas of World Weeds. , (1979).
- CABI, Crop Protection Compendium. Commonwealth Agricultural Bureau International (CABI). , (2007).
- MacDonald, G. E. Cogongrass (Imperata cylindrica) – Biology, ecology, and management. Critical Reviews in Plant Sciences. 23, 367-380 (2004).
- Talley, S. M., Cseke, L. J., Zink, R. Molecular diagnostic technologies for invasive plants. CPHST Fort Collins Laboratory 2009 Annual Report. , 27-28 (2009).
- Dozier, H., Gaffney, J. F., McDonald, S. -. K., Johnson, E. R. R. L., Shilling, D. G. Cogongrass in the United States: History, ecology, impacts, and management. Weed Technology. 12, 737-743 (1998).
- Chikoye, D., Ekeleme, F. Weed flora and soil seedbanks in fields dominated by Imperata cylindrica in the moist savannah of West Africa. Weed Research. 41, 475-490 (2001).
- Weber, E. . Invasive Plant Species of the World: A Reference Guide to Environmental Weeds. , (2003).
- Patterson, D. T. Shading effects on growth and partitioning of plant biomass in Cogongrass (Imperata cylindrica) from shaded and exposed habitats. Weed Science. 28, 735-740 (1980).
- Cole, J. T., Cole, J. C. Ornamental grass growth response to three shade intensities. Journal of Environmental Horticulture. 18, 18-22 (2000).
- Bryson, C. T., Koger, C. H., Byrd, J. D. Effects of temperature and exposure period to heat on cogongrass (Imperata cylindrica) viability. Weed Technology. 21, 141-144 (2007).
- Capo-chichi, L. J. A., Faircloth, W. H., Williamson, A. G., Patterson, M. G., Miller, J. H., van Santen, E. Invasion Dynamics and Genotypic Diversity of Cogongrass (Imperata cylindrica) at the Point of Introduction in the Southeastern United States. Invasive Plant Science and Management. 1 (2), 133-141 (2008).
- Talley, S. M., Ramsey, C. L., Zink, R. Experimentally assessing the invasive potential of plants. CPHST Laboratory 2009 Annual Report. , 29-30 (2009).
- Hodkinson, T. R., Chase, M. W., Lledó, M. D., Salamin, N., Renvoize, S. A. Phylogenetics of Miscanthus, Saccharum and related genera (Saccharinae, Andropogoneae, Poaceae) based on DNA sequences from ITS nuclear ribosomal DNA and plastid trnLintron and trnL-F intergenic spacers. J. Plant Res. 115, 381-392 (2002).
- Kress, W. J., Wurdack, K. J., Zimmer, E. A., Weigt, L. A., Janzen, D. H. Use of DNA barcodes to identify flowering plants. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 102 (23), 8369-8374 (2005).
- Roodt-Wilding, R., Spies, J. J. Phylogenetic relationships in southern African chloridoid grasses (Poaceae) based on nuclear and chloroplast sequence data. Systematics and Biodiversity. 4, 401-415 (2006).
- Brody, J. R., Kern, S. E. Sodium boric acid: a Tris-free, cooler conductive medium for DNA electrophoresis. BioTechniques. 36, 214-216 (2004).
- Chou, C. -. H., Tsai, C. C. Genetic variation in the intergenic spacer of ribosomal DNA of Imperata cylindrica (L.) Beauv. var. major (Cogongrass) populations in Taiwan. Botanical Bulletin of Academia Sinica (Taipei). 40, 319-332 (1999).
