의 야생 - 타입과 장식 품종을 구별하기 PCR 기반 Genotyping 방법 Imperata cylindrica</em

1. 표본 수집 및 보존 이 방법은 개발 신선, 냉동, 그리고 최근 건조 잎 조직을 사용하여 테스트되었습니다. cogongrass 및 / 또는 잔디 수종 식별 전문 taxonomist의 도움으로 조직을 JBG를 식별합니다. 그 밝은 붉은 나뭇잎으로 장식 JBG는 시각 되돌릴 야생 형 cogongrass와 JBG에서 구별 하기란 쉽지 않지만, cogongrass와 JBG 되돌리려 하나를 거의 구별할 수 있습니다. Cogongrass와 JBG 되돌 표현형은 녹색, 긴 잎, 상당히 크고 긴 rhizomes와 JBG 12 (그림 1) 이상의 잎 면적 있습니다. 신선한 잎 조직은 가장 풍부하고 최고 품질의 DNA를 제공하며, 필드 또는 온실 재배 전에서 수집한하실 수 있습니다 cylindrica 공장. 신선한 조직이 사용되는 경우, 저하를 방지하기 위해 수집 3 시간 이내에 DNA를 추출합니다. 그렇지 않으면, 스토리지, keepi위한 조직을 준비직사 광선의 NG 조직 시원한 밖에. 나중에 DNA 추출을위한 조직을 저장하기 위해 가장 최적의 방법은 ° C에서 즉시 -80에서 조직을 동결하고 저장하는 것입니다. 냉동 조직 DNA를 추출 이전 해동하도록 허용하지 마십시오. 해동 막기 위해 DNA를 추출의 분쇄 단계 이전의 액체 질소에 냉동 조직을 전송합니다. -80 ° C의 냉동고를 사용할 수없는 경우, 건조한 조직은 즉시. 건조 저장 들어, 종이 봉투에 조직을 배치하고 건조 실리카 젤 또는 실온에서 다른 활성 desiccants에서 봉투를 저장합니다. 혼합 지표 실리카의 작은 금액으로되지 않은 나타내는 실리카는 그 실리카가에 대해 전적으로 탈수 및 적합 확인을 할 것입 함께 식물 조직을 건조. 최소 10 배 무게에 의한 신선한 잎 조직보다 더 많은 실리카 젤을 사용합니다. 공장 조직은 24 시간 이내에 건조한다. DNA의 품질과 수량 (식물 표본집 검체의 경우와 마찬가지로 시간이 지남에 따라 건식 저장을 통해 감소들). 2. DNA 추출 포르노 수정으로 제조 업체의 지침, 식물 조직에서 DNA를 추출하려면 DNeasy 공장 미니 키트 (고양이 # 69104 또는 69106 Qiagen, 발렌시아, CA)를 따릅니다. 대신 각 항목에 대해 제안된 미만 100 밀리그램 신선한 조직 또는 20 밀리그램 마른 티슈를 사용하는 적절한 튜브로 (마른 티슈 또는> 20 밀리그램) 신선 또는 냉동 조직에서 100 밀리그램을 전송 후 큰 100여 MG를 갈기, 그리고 추출을위한. 원자력 및 plastid DNA가 동시에 추출됩니다. 이 절차를 시작하기 전에, 그 에탄올을 확인하는 것은 버퍼 AP3 / E와 AW 추가되었습니다. 냉장 박격포와 유봉으로 분쇄와 액체 질소의 3 라운드를 사용하여 미세 분말로 신선 또는 냉동 잎 조직 (또는 건조 잎 조직> 20 밀리그램) 중> 100 밀리그램을 갈아서. 시작하는 재료의 부족 중단이나 부족 용해 또한 DNA의 낮은 수율로 이어집니다. 조심스럽게 tiss을 갈다월엔 너무 많은 조직과 열 과부하하지 않습니다. 버퍼 AP1 400 μl와 각 튜브에 작은 선반에 배치할 수 RNase A. 4 μl를 포함하는 1.5 ML의 microcentrifuge 튜브로 신선 또는 냉동 조직 (또는 건조한 조직에서 분말 20 밀리그램)에서 100 밀리그램 냉동 분말을 전송 튜브 당 조직의 정확한 무게를 감시하는 균형. 와동 또는 셰이크 샘플 (들) 혼합 65에서 10 분 동안 부화 ° C, 2-3 회 인큐베이션 기간 동안 반전 튜브 (들).에게 각 샘플로 버퍼 AP2 130 μl를 추가합니다. 반전 튜브 (들)를 여러 번, 그리고 얼음에서 5 분 부화하여 섞는다. Pipet은 각 별도의 QIAshredder의 미니 스핀 컬럼으로 lysate와 2 ML 컬렉션 튜브 (키트와 함께 제공)에서 각 열에 배치합니다. 이 20,000 XG (~ 14,000 RPM)의 분, 각각의 새로운 튜브 (키트와 함께 제공되지 않음)로 분획 흐름 통해 형성 펠렛을 방해하지 않고 전송을위한 원심 분리기 칼럼 (들). / 버퍼 AP3의 1.5 볼륨을 추가E, 그리고 pipetting하여 혼합. 2 ML 수집 튜브 DNeasy 미니 스핀 열에 혼합물보다 650 μl를 전송합니다. 한 6,000 XG (~ 8,000 RPM)에서 분, 그리고 흐름을 통해를 폐기를위한 원심 분리기 칼럼 (들). 각 샘플에 대한 나머지 혼합물이 단계를 반복합니다. 새로운 두 ML 수집 튜브 (들)에 스핀 컬럼 (들)을 놓고, 각 열의 맨 위에 버퍼 AW 500 μl를 추가합니다. 한 6,000 XG (~ 8,000 RPM)에서 분, 그리고 흐름을 통해 폐기를위한 원심 분리기 칼럼 (들). 각 열의 맨 위에 버퍼 AW의 또 다른 500 μl를 추가합니다. 20,000 XG (~ 14,000 RPM)에서 2 분 동안 원심 분리기. 이 단계는 따라서 PCR을 억제 수있는 버퍼에 포함된 잔류 에탄올을 제거 컬럼을 건조합니다. 새로운 1.5 ML의 microcentrifuge 샘플 튜브에 각 스핀 컬럼을 전송합니다. 용리 각 칼럼의 상단에 100 μl 버퍼 AE를 추가하고, 실온에서 5 분 동안 열 (들)을 품어. DNA를 수집하기 위해 6,000 XG (~ 8,000 RPM)에서 1 분을위한 원심 분리기 칼럼 (들). 이러한 용출 샘플 200 μl를 얻을 수있는 동일한 1.5 ML의 microcentrifuge 튜브로 DNA를 eluting, 한 번 단계를 반복합니다. 사용할 때까지 -20 ° C에서 저장 DNA 샘플. DNA의 농도는 조직 유형 및 저장 조건에 따라 다릅니다. 버퍼 AE 200 μl의 총 DNA를 eluting 때 최적의 수율을 얻을되지만 농도가 용출 볼륨이 최소 50 μl로 감소하는 경우 증가 수 있습니다. 3. DNA의 품질 및 수량의 검증 분광 광도계 또는 fluorometer 및 겔 전기 영동을 사용하여 PCR 설치 이전 추출한 DNA의 품질과 수량을 테스트합니다. 이것은 후속 단계의 성공을 위해 필요합니다. 분광 광도계, 테스트 DNA의 품질과 수량을 사용합니다. 좋은 DNA의 수율은 50과 150 사이 여야합니다 2.0에 가까운 280분의 260 및 280분의 230 비율로 μl / NG. 예를 들어, 그림 2 NanoDrop 분광 광도계 (ThermoScientific를 사용하여 양질의 결과를 보여줍니다 윌밍턴, DE). 표준 1퍼센트 아가로 오스 겔을 사용하여 전기 영동을 실시. RNA 오염으로부터 약간 줄이 있고 (그림 3)에없이 비교적 큰 밴드 (> 10 KB)의 존재를 확인합니다. DNA 농도가 높은, 묽은 DNA 샘플 후속 단계 70 NG / μl의 경우. 4. PCR Primers 이 프로토콜에 사용되는 PCR의 primers는 cogongrass와 JBG genotypes의 plastid trnL-F 스페이서 지역 간의 서열의 차이에 바탕을두고 있습니다. 이러한 차이는 SNPs의 형태 (단일 염기 Polymorphisms)과 독특한 시퀀스의 사이트 (그림 4)에서 primers를 찾는하여 다양한 특정 primers의 개발을 허용 InDels (삽입 및 삭제)로 왔습니다. primers의 품질은 PCR 결과에 큰 영향을 줄 수 있습니다. 믿을만한 회사에서 주문 primers. 우리는 경사 바이오 주식 회사 (으로부터 primers를 주문www.obliquebio.com/web/ / :/ "대상 ="_blank "유일한 표준 탈염 절차를 요청> http://www.obliquebio.com/web/, 헌츠빌, AL),. trnL-F 긍정적인 제어 primers : 본 입문서 세트는 11-13 대부분의 잔디 taxa의 plastid trnL-F 스페이서 영역을 증폭하고 좋은 긍정적인 제어 (890 BP 대역에서 발생하는) 역할을한다. 이름 순서 trnF (GAA)-F 5'-ATTTGAACTGGTGACACGAG-3 ' trnL (5 '엑손)-C 5'-CGAAATCGGTAGACGCTACG-3 ' 야생 형 cogongrass의 primers : 본 입문서 세트 cogongrass에만이며 genotypes을 JBG의 trnL-F 영역을 증폭하지 않습니다. 595 BP는 밴드 세트 결과입니다. 이름 Sequence trnLF-C-F1 5'-TCCACTTTTTTGAAAAAACAAGTGCAA-3 ' trnLF-C-R1 5'-GCCGATACTCTAATAAATAAAAAAAAAAAAGAAAT-3 ' JBG와 JBG 것은 primers를 되돌리기 : 본 입문서 세트 유전자형을 JBG에 특정한이며 cogongrass의 trnL-F 영역을 증폭하지 않습니다. 594 BP는 밴드 세트 결과입니다. 이름 순서 trnLF-R-F2 5'-CCAAATCCACTTTTTTGAAAAAACAAGTGGTT-3 ' trnLF-R-R2 5'-CGAGATTCCTTGCCGATACTCTAATAAAA-3 ' -20 ° C, 장기간에 저장될 수 있습니다 100 MM 주식 솔루션을 얻기 위해 nuclease 무료 ddH 2 O의 충분한 볼륨의 각 프라이머를 Resuspend. PCR 설치 단계 이전 12 밀리미터 각 프라이머 주식을 희석. 5. PCR 설정 DNA extractions는 PCR 반응 상기 프라이머 세트의 각을 사용하여 증폭하고 있습니다. 모든 PCR 시약의 잘 일하고 있고 밴드를 생성할 수 있도록 긍정적인 컨트롤을 포함합니다. 시약의 누구도 원하지 않는 DNA로 오염되지 않도록하기 위해 부정적인 컨트롤을 포함합니다. 부정적인 통제는 더 – 템플릿을 포함하지없이 밴드 생산을 초래한다. thermocycler 블록과 시료 사이에 나은 열전달을 허용하도록 얇은 벽으로 둘러싸인 PCR 튜브에있는 모든 반응을 준비합니다. 우리는 오염을 방지하기 위해 상용 에어로졸없는 피펫 팁을 사용하는 것이 좋습니다. 각각의 분리된 DNA 샘플을 보려면 아래 나열된 순서대로 얼음 속에서 다음과 같은 시약을 추가하여 0.2-ML 얇은 벽으로 둘러싸인 PCR 튜브에 상기 프라이머 세트의 각을 사용하여 50 μl PCR 반응을 설정합니다. 여러 샘플 준비중인 경우를 제외한 모든 시약이 들어있는 칵테일 만들기DNA를 템플릿의 모든 반응 사이의 균일한 조건을 설정합니다. PCR 시약 사용하는 볼륨 최종 Concetration Nuclease 무료 ddH 2 O 40.5 μl 10X 장점이 PCR 버퍼 (Clonetech, CA) 5.0 μl 10 % (V / V) 장점 UltraPure PCR dNTP 믹스 (10 MM 각 Clonetech, CA) 1.0 μl 0.2 MM 프라이머 1 (ddH 2 O에서 12μM) 1.0 μl 0.24 μm의 프라이머 2 (ddH 2 O에서 12μM) 1.0 μl 0.24 μm의 장점이 효소 믹스 (Clonetech, CA) 0.5 μl 1퍼센트 (V / V) DNA 추출(70 NG / 반응, 필요에 따라 ddH 2 O 볼륨을 조절) 1.0 μl 1.4 NG / μl 합계 : 50.0 μl 모든 PCR의 시약이 잘 작동하는지 확인하려면 긍정적인 제어 primers를 사용하여 긍정적인 제어를 설정.이 입문서 세트는 되돌릴 및 기타 목초를 JBG, cogongrass, JBG과 동일하게 작동하며 890 BP는 밴드가 높아집니다. 대신 DNA를 추출 ddH 2 O를 사용하여 긍정적인 제어로 설정 같은 컨트롤 프라이머를 사용하여 부정적인 컨트롤을 설치합니다. 모든 시약은 DNA가 오염의 무료면,이 반응은 어떠한 밴드집니다. DNA의 농도가 낮은 경우, 더 많은 DNA가 Nuclease없는 ddH 2 O의 양을가 50 μl로 총 반응 량을 가져다 주곤 조정, 각 반응에 추가할 수 있습니다. DNA의 5 개 이상 μl (10 %를 사용하지 마십시오 R 당 총 볼륨)eaction, DNA 샘플에 포함된 가능한 불순물은 PCR 반응을 억제하실 수 있습니다. 6. PCR 사이클링 다음 PCR 사이클 매개 변수를 사용하여 온수 뚜껑을 갖춘 thermocycler에서 PCR amplifications을 수행. 우리는 표준 온도 올렸 조건으로 작동하도록 설정 Mastercycle 프로 S thermocycler을 (Eppendorf, Hauppauge, NY)을 사용합니다. 모든 품질 thermocycler 잘 수행한다. 주기 어닐링 변성 중합 일 95시 2 분 ° C 2 95 ° C에서 30 초 30 초 61에 ° C에서 90 초 68에 ° C에서 35 사이클 3 68시 5 분 ° C 샘플을 제거 ° C까지 4에 잡아 </TD> DNA의 품질에 따라 필요에 따라 PCR (뇌관 어닐링 온도, 연장 시간, 순환의 수를 포함)에 대한 조건을 최적화 primers는 thermocycler의 DNA 형성 촉매의 중합 효소 또는 유형이 사용됩니다. 우리는 최적의를 결정할 때 그라디언트 능력 thermocycler를 사용하는 것이 좋습니다 온도 풀림. 사용중인 thermocycler는 온수 뚜껑이없는 경우, PCR 사이클 동안 증발을 방지하기 위해 각 시료의 상단에 미네랄 오일 1 방울을 추가합니다. 7. PCR 제품의 젤 전기 영동 분석의 결과를 시각화하는 표준 전기 영동을 사용하여 1 % 아가로 오스 겔에 대한 별도의 PCR 제품. 각각의 증폭 PCR 제품의 5 μl와 표준 DNA를 로딩 버퍼 2 μl (일반적으로 5 배 또는 6x 용액)을 결합. 전자로 만든 EtBr을 (DNA의 염색법에 대한 ethidium의 브로마이드)이 포함된 1 % 아가로 오스 겔에 샘플을로드ither 태 또는 SB (나트륨 borate)는 버퍼 시스템 16. 우리는 100 ML 1퍼센트 아가로 오스 (0.1 μg / ml) 쇼핑 당 10 밀리그램 / ML EtBr 주식 솔루션 1 μl를 사용합니다. 염료 전면에 도달할 때까지 ~ 120V에서 샘플을 실행하여 일정한 젤의 총 길이. 자외선 아래에서 (단파 자외선 라이트 박스 등), 적절한 단편이 증폭되었다 있는지 결과 밴드를 검사. 가능한 사진 문서 시스템 또는 카메라를 사용하여 겔과 결과 밴드 문서. 8. 대표 결과 PCR 제품의 가시화되면 cogongrass은 JBG 또는 JBG을 (그림 5) 복귀의에 비해 독특한 banding 패턴을 가지고 있습니다. 각각의 DNA 샘플을 보려면 trnL-F 긍정적인 컨트롤 프라이머 세트 ~ 890 BP의 단일 높은 농도 대역을 초래한다. 이것은 모든 PCR 시약 제품이 잘 작동하는지 확인합니다. 마찬가지로 부정적인 컨트롤 (없음 템플릿) 반응은 어떤 입문서의에 대한 밴드 포함되어서는 안됩니다동부 표준시가 사용됩니다. 이것은 시약 중 누구도 오염되지 않았습니다 확인합니다. DNA 샘플은 야생 형 cogongrass, JBG 특정 primers은 어떠한 밴드가 높아집니다 동안 cogongrass 특정 프라이머 세트는 ~ 595 BP의 단일 밴드가 높아집니다를 사용하여 PCR 반응에서 파생되는 경우. DNA 샘플은 JBG에서 파생된 또는 JBG 되돌 경우 cogongrass 특정 primers은 어떠한 밴드가 높아집니다 동안 마찬가지로, JBG 특정 프라이머 세트를 사용하여 PCR 반응시 ~ 594 BP 하나의 밴드가 높아집니다. JBG와 JBG 복귀하는 것은 동일한 핵산 서열을 가지고 있기 때문에, 그들은 따라서 동일한 banding 패턴을해야합니다. 많은 시료가 동시에 겔에 비교 될 경우, 우리는 이렇게 쉽게 긍정적인 결과에 대한 샘플을 스캔하고, 서로 옆에있는 설정 각 프라이머에서 파생된 모든 샘플을 실행하는 것이 좋습니다. 갑니다을 JBG와 JBG 간의 형태학의 차이는 매우 분명 (나뭇잎과 JB의 작은 키가의 예 : 붉은 색 PCR 결과가 동일합니다 반면 G 대 녹색 착색, 더 큰 성장과 JBG의 공격적인 성장을 되돌리려면)은, 그러니까, JBG 종류의 식물 형태를 사용하여 구분하기 쉽습니다. 그림 1. Imperata cylindrica VAR. koenigii (일본어 혈액 잔디)를 재배 온실의 비교는 마찬가지 되돌림 cylindrica VAR. koenigii (JBG는 되돌리기)과 나 cylindrica (야생 형 cogongrass). 그림 2. NanoDrop 분광 광도계를 사용하여 확인된 DNA 샘플의 예. , 상관없이 사용되는 분광 광도계의, 280분의 260 비율이 가까운 1.8에 있어야하며 230분의 260 비율이 2.0으로 가까이해야합니다. ontent "> 그림 3. DNA 샘플은 1 % 아가로 오스 겔에 표준 겔 전기 영동을 사용하여 확인. 상업적 유전자 마커는 크기 분석에 사용되었다. 레인 # 4 번짐 및 일부 RNA 오염을 보여주는, 품질이 낮은 DNA 샘플의 예입니다. Imperata cylindrica VAR. koenigii (일본어 혈액 풀)의 trnL-F 영역의 그림 4. 순서 정렬 마찬가 되돌림 cylindrica VAR. koenigii (JBG는 되돌리기)과 나 cylindrica (야생 형 cogongrass). 수직 검은 화살표 SNPs와 InDels으로 인한 시퀀스의 차이를 나타냅니다. 수평 녹색 화살표 cogongrass 특정 PCR에 사용되는 와일드 타입 cogongrass의 primers의 위치를​​ 나타냅니다. 수평 빨간색 화살표는 PO를 나타내는JBG와 JBG의 sitions은 JBG 특정 PCR에 사용된 primers를 되돌리기. 그림 5. cogongrass 및 JBG 특정 primers로뿐만 아니라 trnL-F 긍정적인 제어 및 템플릿 부정적인 통제없이 결합의 DNA 샘플을 JBG하고 되돌릴 JBG cogongrass에서 파생 PCR 제품의 겔 전기 영동의 대표적인 결과를 가져올 수도 있습니다.