Ein PCR-basierte Genotypisierung Methode, zwischen Wildtyp-und Ziersorten Unterscheiden von Imperata cylindrica</em
Summary
Wir bieten eine kostengünstige und schnelle molekulare Genotypisierung Protokoll, das Vielfalt-spezifische PCR-Primer verwendet, die Ziel-DNA-Sequenz Unterschiede innerhalb der Chloroplasten trnL-F Spacer-Region, zwischen Sorten unterscheiden<em> Imperata cylindrica</em> (Cogongrass), die nicht durch Morphologie allein unterschieden werden. Diese Sorten gehören die vom Bund aufgelistet schädliches Unkraut, cogongrass und eng verwandten, weit verbreitete ornamentalen Vielfalt, ich<em>. cylindrica</em> Var.<em> Koenigii</em> (Japanische Blut Gras).
Abstract
Wild-Typ I. cylindrica (cogongrass) gehört zu den Top Ten der schlimmsten invasiven Pflanzen in der Welt, negative Auswirkungen auf Landwirtschaft und natürliche Ressourcen in 73 verschiedenen Ländern in ganz Afrika, Asien, Europa, Neuseeland, Ozeanien und Amerika 2.1. Cogongrass bildet sich schnell verbreitenden, monodominant Ständen, die eine große Vielfalt an einheimischen Pflanzenarten verdrängen und wiederum bedrohen die heimische Tierwelt, die auf den Vertriebenen einheimischen Pflanzenarten für Futter und Unterkunft ab. Um auf das Problem hinzu, eine ornamentale Vielfalt [I. cylindrica var. koenigii (Retzius)] ist weit verbreitet unter den Namen Imperata cylindrica 'Rubra', Red Baron und Japanisch Blut Gras (JBG) vermarktet. Diese Sorte ist vermeintlich sterilen und nicht-invasive und gilt als eine wünschenswerte Zier für seine rot gefärbten Blättern. Doch unter den richtigen Bedingungen kann JBG produzieren lebensfähige Samen (Carol Holko, 2009 persönliche Mitteilung) und kann zu einem grünen zurückkehren invasive Form, die oft nicht zu unterscheiden ist von cogongrass wie es auf den besonderen Charakteristika des Wildtyp-invasive Vielfalt 4 (Abbildung 1) erfolgt. Dies macht die Identifizierung mit der Morphologie eine schwierige Aufgabe, auch für gut trainierte Pflanzensystematiker. Reversion von JBG zu einem aggressiven grünen Phänotyp ist auch keine Seltenheit. Mit Ablauf der kodierenden und variablen Regionen im kerntechnischen und Chloroplasten-DNA, haben wir bestätigt, dass JBG hat mit dem grünen invasiv in den Staaten Maryland, South Carolina und Missouri zurückgekehrt. JBG ist verkauft worden und in fast jedem Staat gepflanzt in den kontinentalen USA, wo es keine aktive cogongrass Befall. Das Ausmaß des Problems wieder in nicht gut verstanden, weil zurückgekehrt Pflanzen sind nicht dokumentiert und oft zerstört.
Die Anwendung dieser molekularen Protokoll stellt eine Methode zur Identifizierung JBG kehrt und können helfen, diese Sorten von Co-vorkommende einND möglicherweise Hybridisierung. Cogongrass ist ein obligat outcrosser und, wenn mit einem anderen Genotyp überschritten, können lebensfähige Wind verteilt Samen, die über weite Entfernungen cogongrass 7.5 zu verbreiten. JBG hat eine etwas andere Genotypen als cogongrass und kann in der Lage, lebensfähige Hybride mit cogongrass bilden. Um auf das Problem hinzu, ist JBG mehr Kälte und Schatten toleranter als cogongrass 8-10, und Genfluss zwischen diesen beiden Sorten ist wahrscheinlich Hybriden, die aggressiver sind zu generieren, Schatten tolerant, und winterhart als Wildtyp-cogongrass. Während Wildtyp-cogongrass befällt derzeit über 490 Millionen Hektar weltweit, im Südosten der USA befällt es über 500.000 Hektar und ist in der Lage besetzen die meisten von den USA, wie es breitet sich schnell nach Norden wegen seiner breiten Nische und geographische Potenzial 3,7,11. Das Potenzial für eine genetische Kreuzung ist ein ernstes Problem für die USDA-APHIS Federal Noxious Wochenprogramm. Derzeit verbietet die USDA-APHIS JBG in Staaten where gibt es große cogongrass Befall (z. B. Florida, Alabama, Mississippi). Allerdings kann verhindern, dass die beiden Sorten aus der Kombination als schwieriger erweisen als cogongrass JBG und erweitern ihre Distributionen. Ferner ist die Verteilung der JBG wieder derzeit nicht bekannt und ohne die Möglichkeit, diese Sorten durch Morphologie zu identifizieren, einige cogongrass Befall kann das Ergebnis der JBG kehrt sein. Leider aktuellen molekularen Methoden der Identifikation in der Regel verlassen sich auf AFLP (Amplified Fragment Length Polymorphismen) und DNA-Sequenzierung, die beide zeitaufwändig und kostspielig sind. Hier präsentieren wir die erste kostengünstige und zuverlässige PCR-basierter molekularer Genotypisierung Methode, um genau zwischen cogongrass und JBG zurückkehren zu unterscheiden.
Protocol
Discussion
Die US-Gärtnerei und Landschaftspflege Industrien leben vom Anbau und Verkauf exotischer und neuartige Pflanzenarten. Diese, mit der zunehmenden Globalisierung des Handels verbunden ist, erhöht die Chancen, dass eine invasive Pflanzenarten geben, zu etablieren, wird verteilt und in den USA die Fähigkeit, staatlich zu regulieren, wie Pflanzen beruht auf Informationen, die oft nicht zur Verfügung steht, einschließlich der Möglichkeit, sich invasiven , korrekte Taxonomie und genetische Verschiedenheit von einheimischen und eingebürgerten Taxa. Da unser Wissen über invasive Pflanzen ist oft begrenzt, haben importierten Pflanzen mit versteckten invasiven Eigenschaften wurden bereitwillig eingeführt, nur um später zu erfahren, dass sie unsere Landwirtschaft und natürliche Ressourcen zu erobern. Dieses Protokoll zielt darauf ab, solche Probleme mit I. verbunden sind, anzugehen cylindrica Sorten durch die Bereitstellung der ersten molekularen vereinfachte Methode, die genau zwischen den Wildtyp-cogongrass und kehrte Form seiner ornamentalen JBG Gegenstück unterscheiden kann.
jove_content "> Für die Entwicklung dieses Protokolls, wurde Wildtyp-cogongrass aus eingebürgerte Populationen an der Pond Creek Forstwirtschaft Einheit in Santa Rosa County in der Nähe von Jay, FL im Juni 2008 gesammelt werden. JBG wurde von einem kommerziellen Kindergarten (Bluebird Nursery Inc beschafft .) im Juni 2008 sowie vom Hausbesitzer die Sammlung in Columbia, kehrt MO JBG wurden aus dem Hof des Campbell Geologisches Museum an der Clemson University, SC erhalten im Juni 2008;. aus University Park in Riverdale, MA im Juni 2009; und aus dem Vorgarten eines Hausbesitzer in Columbia, MO im Jahr 2009 (identifiziert durch Leland Cseke). Alle Pflanzen wurden in einem Gewächshaus an der Universität von Alabama in Huntsville (Huntsville, AL) entfernt gehalten.Genetische Sequenzierung von DNA aus diesen Pflanzen gesammelten enthalten die eingehenden Vergleich von 9 unabhängigen DNA-Regionen allgemein Barcode Pflanzen 2 verwendet. In allen Fällen waren die Sequenzen von JBG eine 100% ige Übereinstimmung mit denen der JBG zurück, was zurüberprüfen, ob JBG in der Tat zu einem grünen, invasive Form zurückkehren. Nur der nuklearen ITS und die Chloroplasten trnL-F Regionen haben Differenzen, die verwendet werden, um genetisch zwischen cogongrass und JBG unterschieden werden kann. Die ITS-Region hat eine Gesamtfläche von 3 SNPs (single nucleotide polymorphisms) zwischen cogongrass und JBG, während die trnL-F-Region verfügt über 2 SNPs und 2 indels (Insertionen und Deletionen). Diese genetischen Unterschiede erlaubt Vielfalt-spezifische PCR-Primer zu entwickeln, welches zwischen Wildtyp-und cogongrass JBG kehrt zu unterscheiden. Die zuverlässigsten Ergebnisse wurden von Primern aus dem Plastid trnL-F abgeleitet Region kommen. Somit ist dieses Protokoll auf der Sequenzunterschiede zwischen den trnL-F Regionen der Chloroplasten-Genom cogongrass, JBG und kehrte JBG (Abbildung 4) basiert.
Damit erzeugen Primer, die eher typisch für die betreffenden Sorten sind und zur Vermeidung von Fehlalarmen aus nahe verwandten Arten, all bekannt trnL-F-Sequenzen von I. cylindrica Sorten wurden mit trnL-F-Sequenzen aus verwandten Grasart (43 unabhängige Sequenzen aus 29 Arten, z. B. Cymbopogon citratus, Sorghastrum incompletum, Coix lacryma-Jobi, Miscanthus sinensis, Saccharum officinarum, Sorghum halepense) verglichen. Obwohl, wir Vielfalt-spezifischen Primer-Sequenzen untersucht, über 29 Arten von Gras, die Spezifität der Vielfalt-spezifische Primer wurde noch nicht umfassend für seine Fähigkeit, DNA aus den meisten anderen Grasarten verstärken untersucht. Folglich sollten Gewebe für eine DNA-Extraktion verwendet sorgfältig wie I. identifiziert werden cylindrica vor Beginn dieses Protokoll. Wenn das Gras nicht als entweder cogongrass oder JBG identifiziert werden, dann empfehlen wir die Sequenzierung des PCR-Produkt, um sicherzustellen, dass Sequenzen, um eine exakte Übereinstimmung cogongrass oder JBG sind. Derzeit ist die genaueste Methode, um die Identität einer bestimmten Probe zu überprüfen Gras PCR bei den T-durchführenRNL-F und seine Regionen, gefolgt von der Sequenz Überprüfung der PCR-Produkte und der Vergleich der Sequenzen zu bekannten Sequenzen von genau identifiziert Taxa. DNA kann verstärkt mit Kontroll-Primer in diesem Protokoll aufgeführt (für die Region trnL-F) oder anderen Primern, dass in anderen Publikationen 13-15 werden. Die Sequenzierung ist viel mehr arbeits-und kostenintensiv als der Einsatz unserer vereinfachten Verfahren.
Die Qualität der Primer für die PCR verwendet wird, ist entscheidend für den Erfolg des Verfahrens. Wir haben die Primer für dieses Verfahren erhältlich von Bio Schrägansicht, Inc. (hergestellt http://www.obliquebio.com/web/ , Huntsville, AL). Der Vorteil für die Bestellung der Primer von Oblique Bio ist, dass sie eine große Anzahl von Aliquots von jedem Primer aus der identischen Probe-Baureihe als die Primer, die wir für die Optimierung in unserem Labor verwendet zu speichern. Folglich Primer nicht nur die gleiche Sequenz, aber they aus exakt den gleichen Produktionscharge, die in diesem Protokoll verwendet wurde, kommen. Unter Verwendung der Primer aus derselben Charge, können zur Vermeidung von externen Variablen in der Prozedur, die von Unterschieden in der Qualität der PCR-Primer zur Folge haben kann. Ebenso wird während andere Taq-Polymerasen sollte aber für PCR, die Qualität der Taq-Polymerase verwendet feine Auswirkungen auf die Qualität der PCR-Ergebnisse. Um eine bessere Konsistenz in PCR-Reagenzien ermöglichen, haben wir das Protokoll unter Verwendung von Reagenzien von Clontech optimiert. Der Vorteil 2 Polymerase (Clontech, Mountain View, CA, Kat. Nr. 639201 oder 639202) ist eine Mischung aus einem robusten, Hot-Start Taq-Polymerase und ein Lektorat Enzym, das eine hohe Spezifität und genauere Verstärkungen sorgen hilft.
Da dieses Protokoll beruht auf Chloroplasten-DNA, die das Muttertier in Gräsern vererbt wird, kann die Hybridisierung zwischen Ereignissen und cogongrass JBG Genotypen nicht mit unseren molekulare Identifizierung Verfahren erfasst werden. In Fällen, in denen hypridization ist & Fahrwerkcted, empfehlen wir die Verwendung nuklearer Regionen, die von beiden Eltern vererbt werden. Die am häufigsten verwendeten nicht-variable Region Plastiden in Pflanzenzellen Genotypisierung Aspekt ist die nukleare ribosomalen ITS-Region 13-15,17. Derzeit machen wir Fortschritte in Richtung Multiplexen der Verstärkung des Chloroplasten trnL-F-Region mit der des nuklearen ITS-Region in der gleichen PCR-Röhrchen. Multiplexen mit Kern-DNA-Regionen Plastiden würde möglicherweise eine Umgehung der Einschränkungen bei der Verwendung entweder allein, allerdings verlangen, dass diese Methoden Optimierung und zusätzliche Auswertung zur Machbarkeit auf einer von Fall zu Fall zu bestimmen. Der Einsatz von quantitativen real-time PCR (qPCR) und neuere Technologien, wie z. B. Molecular Beacons (fluoreszierenden Primer-Sonden), werden auch als Fail-Safe-Anlage und genaue Genotypisierung Methoden ausgewertet.
Die hier vorgestellte Protokoll bietet eine schnelle und zuverlässige Methode zur Unterscheidung der JBG von dem der Wildtyp-cogongrass zurück. Wir ermutigen Siers dieses Protokoll, um Kontakt mit uns auf, um Ergebnisse aus der Verwendung von diesem Protokoll ergeben, zu berichten. Solche gemeinsamen Information wird dazu beitragen, Informationen über die Verteilung der JBG zurückkehrt. Dies wird auch dazu beitragen Regulierungsbehörden auf der USDA fundierte Entscheidungen über Maßnahmen, die werden müssen, kann die Ausbreitung und mögliche Hybridisierung der sehr invasiv cogongrass Sorten zu umgehen.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wir danken Alan Tasker (USDA-APHIS, Riverdale, MD), Stephen Compton (Clemson), Sherry Aultman (Clemson), Craig Ramsey (USDA-APHIS, Fort Collins, CO), und Betty Marose (UMD) für die Hilfe bei der Beschaffung Proben . Wir bedanken uns bei Studenten Andrew Adrian (UA-Huntsville) und Derek Thacker (UA-Huntsville) für ihre Unterstützung bei der Erprobung dieses Protokoll, und Joseph Herdy für seine Arbeit in den Dreharbeiten zu dem Video. Diese Arbeit wurde vom National Fish and Wildlife Foundation finanziert.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
| DNeasy Plant Mini Kit | Qiagen, Valencia, CA | 69104 or 69106 | Any reputable genomic plant DNA kit that yields good quality DNA should work fine for these procedures. |
| trnF(GAA)-F | Oblique Bio, Inc. | 3-0578 | Forward positive control primer |
| trnL(5′ exon)-C | Oblique Bio, Inc. | 3-0579 | Reverse positive control primer |
| trnLF-C-F1 | Oblique Bio, Inc. | 3-0864 | Forward wild-type cogongrass primer |
| trnLF-C-R1 | Oblique Bio, Inc. | 3-0865 | Reverse wild-type cogongrass primer |
| trnLF-R-F2 | Oblique Bio, Inc. | 3-0866 | Forward JBG and JBG revert primer |
| trnLF-R-R2 | Oblique Bio, Inc. | 3-0867 | Reverse JBG and JBG revert primer |
| Advantage UltraPure PCR dNTP Mix | Clontech, Mountain View, CA | 639125 | |
| Advantage 2 Polymerase | Clontech, Mountain View, CA | 639201 or 639202 | A good proof-reading, hot-start Taq polymerase |
References
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