DT40 ، وهو نظام الفقاريات نموذج الجيني ، ويوفر أداة قوية لتحليل وظيفة البروتين. نحن هنا وصف طريقة بسيطة تسمح التحليل النوعي من المعلمات التي تؤثر على الحمض النووي التوليف خلال المرحلة – S DT40 في الخلايا على مستوى جزيء واحد.
الحفاظ على الاستقرار شوكة تكرار أمر في غاية الأهمية لتقسيم الخلايا للحفاظ على سلامة والوقاية من المرض. العمليات التي ينطوي ليس فقط ضمان المؤمنين الجينوم الازدواجية في مواجهة الحمض النووي من التلف الداخلية والخارجية ولكن أيضا منع عدم الاستقرار الجيني ، وهو عامل المسبب للمرض معترف بها في مجال التنمية الورم.
هنا ، نحن تصف المجهري المستندة بسيطة وفعالة من حيث التكلفة مضان طريقة لتصور تكرار الحمض النووي في الخلية خط B – DT40 الطيور. هذا الخط الخلية يوفر أداة قوية لتحقيق وظيفة البروتين في الجسم الحي بواسطة الهندسة الوراثية المعكوسة في خلايا الفقاريات 1. تصوير تألقي في الحمض النووي الألياف DT40 خلايا تفتقر إلى جين معين يسمح احد لتوضيح وظيفة هذا المنتج الجيني في تكرار الحمض النووي واستقرار الجينوم. الطرق التقليدية لتحليل ديناميات شوكة تكرارها في خلايا الفقاريات تعتمد على قياس المعدل العام للتوليف الحمض النووي من السكان البالغ عددهم نبض الخلايا المسمى. هذا هو النهج الكمي ، ولا تسمح للتحليل النوعي للمعلمات التي تؤثر في تركيب الحامض النووي. في المقابل ، يمكن أن يتبع معدل حركة نشطة من الشوك مباشرة عند استخدام تقنية الحمض النووي الألياف 2-4. في هذا النهج ، هو المسمى DNA الوليدة في الجسم الحي بواسطة إدماج النيوكليوتيدات المهلجنة (الشكل 1A). بعد ذلك ، يتم تمدد الألياف الفردية على شريحة المجهر ، وأساء إلى تكرار الحمض النووي المسمى مساحات محددة مع الأجسام المضادة والتي تصور المجهري مضان (الشكل 1B). يتم تحديد بدء النسخ المتماثل وكذلك اتجاهها تفرع عن طريق استخدام اثنين من نظائرها على التوالي تعديل مختلف. وعلاوة على ذلك ، فإن النهج المزدوج الوسم يسمح التحليل الكمي من المعلمات التي تؤثر على الحمض النووي التوليف خلال المرحلة – S ، أي تكرار هياكل مثل شوك الجارية والمتوقفة ، والنسخ الأصلية الكثافة وكذلك إنهاء الشوكة. أخيرا ، يمكن أن يكون الإجراء التجريبي إنجازإد في غضون يوم ، ويتطلب معدات المختبرات العامة وفقط المجهر مضان.
نحن تصف الطريقة التي تسمح للتحليل الكمي من المعلمات التي تؤثر على الحمض النووي خلال مرحلة التوليف – S في مستوى جزيء واحد. على مدى السنوات العشر الماضية ، تم وضع صيغ مختلفة للتصوير تألقي تقنية الحمض النووي الألياف لتصور حركة الشوك المتماثل الفردية داخل الخلايا الحية. المعلمة حاسما في كل هذه التقنيات هي الإجراءات المتبعة لتحقيق أفضل ما يمكن من الحمض النووي التي تمتد على الأسطح الزجاجية توفير ألياف الحمض النووي جيدا المشتتة. خطوة حاسمة لتحقيق هذا هو الوقت المناسب للحضانة وقف الخلية على الشريحة المجهر ، فضلا عن الوقت تحلل. هذه المعايير تعتمد على درجة الحرارة وتدفق الهواء في مختبر خاص ، وينبغي أن تحدد تجريبيا. عادة يتم إنجاز الجزء العملي للتجربة ألياف الحمض النووي خلال يوم واحد. ومع ذلك ، بعد اكتساب صورة والتحليل هو أكثر استهلاكا للوقت وتتطلب الممارسة.
يمكن أن يكون بروتوكول وضع العلامات الإعلانيةapted للرد على المشاكل العلمية المختلفة : استخدام عامل الذي يتداخل مع تكرار خلال وضع العلامات نبض second مراقبين استطالة شوكة / المماطلة في الاستجابة للإجهاد تنسخي. وأضاف في هذا السيناريو ، التسمية الأولى لا تحتاج إلى أن تكون جرفت كما النوكليوتيدات الثانية في الزائدة. بدلا من ذلك ، يمكن استخدام الأدوية التي تعوق تطبيقها في تركيبة أو بعد إضافة التسمية الأولى. وهذا يتطلب التسمية الأولى ويطبق الدواء المراد إزالتها قبل التماثلية والنوكليوتيدات الثانية. هذا الإجراء يسمح احد لتحديد أهمية العوامل المختلفة إصلاح الحمض النووي على الاستقرار شوكة تنسخي / الانتعاش في ظل ظروف الضغط تنسخي (أي شوكة المماطلة و / أو انهيار). الجدير بالذكر أنه يمكن إجراء تحليل أكثر تفصيلا للتفاصيل ال DNA برنامج النسخ المتماثل مع استخدام أساليب بديلة لجمع الحمض النووي تمشيط ومضان والتهجين في الموقع. هذا ومع ذلك ، من الناحية التقنية أكثر تحديا ويتطلب expenSIVE المعدات.
القدرة على تحليل نوعيا وكميا تفاصيل تكرار الحمض النووي يوفر أداة أساسية لتحقيق عيوب في تكرار الحمض النووي في حد ذاته ، وكذلك الممرات التي تقمع عدم الاستقرار الجيني المرتبطة الشوك تكرارها. مما لا شك فيه ، فإن هذا الاختبار على مزيد من المساعدة لتسليط الضوء على آليات النسخ بوساطة إصلاح الحمض النووي التي تسمح للخلايا الطبيعية للرد / التكيف مع التغيرات البيئية وكذلك كيفية الاستفادة من هذه الخلايا السرطانية آليات لمقاومة سمية العقاقير التي تستهدف الشوك تكرارها.
The authors have nothing to disclose.
نشكر الدكتور T. Helleday والدكتور بيترمان E. للحصول على مساعدة تقنية من الألياف وكذلك أعضاء في مختبر للمناقشة مفيدة. معتمد من قبل WN الزمالة الدولية للبحوث كبار من الرابطة الدولية لبحوث السرطان واللجنة الدولة البولندية للبحث العلمي المنح (N301 165935).
Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
---|---|---|---|
Fetal bovine serum gold (FBS) | PAA | A15-151 | |
Chicken serum | Sigma | C5405 | |
Penicillin/Streptomycin | PAA | P11-010 | |
RPMI 1640 | Gibco | 21875 | |
5-Iodo-2′-deoxyuridine (IdU) | Sigma-Aldrich | I7125 | |
5-Chloro-2′-deoxy-uridine (CldU) | Sigma | C6891 | |
Microscope slides SuperFrost | VWR | 631-0910 | |
Cover slips No1 | Scientific lab suppplies | MIC3234 | |
Vectashield mounting medium | H-1000 Vector lab | H-1000 | |
Anti-BrdU antibody (mouse) | BD Biosciences | 347580 | |
Anti-BrdU antibody (rat) | Abcam | ab6326 | |
sheep anti-mouse Cy3 | Sigma | C2181 | |
goat anti-rat Alexa Fluor 488 antibody | Invitrogen | A110060 | |