Specimen Voorbereiding, Imaging, en Analyse Protocollen voor Knife-edge Scanning Microscopie

1. Prepareren: Golgi-Cox Dit protocol sluit nauw aan bij het ​​protocol van Mayerich et al.. 7. De C57BL/6J muis is diep verdoofd met isofluraan inhalatie-anesthesie en vervolgens onthoofd. De hersenen is verwijderd en geplaatst in een Golgi-Cox fixatie-oplossing (1% kalium chromaat, 1% kaliumdichromaat, en 1% kwikchloride in gedeïoniseerd water). De hersenen zijn nog in de Golgi-Cox-oplossing in het donker, bij kamertemperatuur, voor 10 tot 16 weken. De hersenen zijn gespoeld in gedemineraliseerd water 's nachts in het donker. De hersenen gespoeld wordt ondergedompeld in een 5% ammoniumhydroxideoplossing in gedeïoniseerd water voor 7 tot 10 dagen in het donker bij kamertemperatuur. Deze lange voorbereidingstijd was om infiltratie van de hele hersenen zorgen, zodat de zwarte neerslag een kans om geheel vormen in het weefsel had. De hersenen zijn weer gespoeld in gedemineraliseerd water bij kamertemperatuur gedurende 4 uur en tkip gedehydrateerd door middel van een gegradeerde reeks van ethyl alcohol: 50% en 70% in de koelkast (4 ° C), en 85%, 95% (3 veranderingen), en 100% (4 tot 5 veranderingen) in de kamertemperatuur. De hersenen zijn nog in elke oplossing voor 24 uur. De gedroogde hersenen wordt vervolgens in aceton (3 tot 4 veranderingen, elk voor een dag), gevolgd door een Araldite-aceton-mengsel met Araldite-to-aceton-verhouding van 1:2, 1:1, 2:1, en tenslotte in 100% Araldite (3 verandert, elke keer 's nachts), in de koelkast (4 ° C). Tenslotte wordt de behandelde hersenen zijn ingebed in 100% Araldite en verwarmd tot 60 ° C gedurende 3 dagen (cf. inbedding protocol in de Abbott en Sotelo 2). Indien monsters zijn ingebed in LR White dan de specimens worden overgedragen van de laatste 100% ethanol-oplossing door middel van drie veranderingen van LR White oplossing die elk bewaard nacht in de koelkast, dat is een standaard procedure, voorafgaand aan polymerisatie. Drie wijzigingen zijn doen om de volledige infiltratie te verzekeren. Het monster is tkip overgezet op vers LR White, dat is gepolymeriseerd in een ongeopende verpakking bij 60 ° C gedurende 24 uur, dat is de benodigde hoeveelheid tijd en temperatuur voor een goede polymerisatie. Fig. 1 toont een Golgi-Cox-lood hersenen ingebed in Araldite. De uitgeharde monster blok is vervolgens gemonteerd op de metalen ring met behulp van epoxy monster, en de zijkanten van het blok gesneden als nodig is (zie Fig. 2). 2. Prepareren: Nissl De muis is diep verdoofd met behulp van ketamine en xylazine (1,7 mg ketamine / 0,26 mg xylazine per 20 gram lichaamsgewicht) intraperitoneaal geïnjecteerd en vervolgens doorbloed transcardially met behulp van 50 ml van de ruimtetemperatuur fosfaat-gebufferde zoutoplossing (pH 7,4), gevolgd door 250 ml room temperatuur 10% neutraal gebufferde formaline (pH 7,4). en ten slotte met 3,0 cc van onverdunde Oost-Indische inkt. Hele lichaam perfusie met zoutoplossing en fixatief is nodig om het bloed uit het cardiovasculaire systeem en voor de ti vast PUNTEN. Perfusie met Oost-Indische inkt is nodig om volledig te vullen het vaatstelsel van het cardiovasculaire systeem. De resulterende hersenen wordt vervolgens gedehydrateerd door een reeks van gesorteerde ethyl alcohol (25% -100%) en vervolgens ingebed in Araldite plastic na het protocol in 1.8-1.9 hierboven. Als LR wit is de inbedding medium dan het protocol in 1.10 hierboven is gevolgd. 4. Prepareren: Generic soorten, generieke organen Voor de generieke geval is, kan fixatie worden gedaan met ofwel 10% neutraal gebufferde formaline of 4% paraformaldehyde. Voor kleine hoeveelheden weefsel, is diffusie plaats van de perfusie aanbevolen voor fixatie en kleuring. In het geval van kleine organismen of organen, kunnen vlekken ook worden gedaan tijdens het droogproces. De inbedding protocol is hetzelfde als hierboven, maar de tijden voor oplossing infiltratie kan worden verminderd voor organen of organismen die veel kleiner zijn dan hele hersenen van muizen. jove_title "> 5. KESM setup en imaging Zet de pomp, zet op het podium, zet de camera, zet verlichting. Verhogen mes en objectief. Installeer exemplaar ring. Meten monster dimensie en maakt een configuratiebestand voor de KESM Stage Controller2 toepassing. Start KESM Stage Controller2 en initialiseren podium. Onderste mes / doelstelling, zet pomp. Focus objectief en de camera, door te draaien aan de focus knop op de optische trein en het aanpassen van de camera's gezichtsveld van ten opzichte van het mes rand. Druk op [Start] om beeldvorming te starten. Zie Fig. 3-8. Zie 9, 7 voor technische details. 6. Beeldverwerking en data voorbereiding Kopieer de KESM Stack Processor executable in de map Data onder het configuratiebestand map (00000, 00001, etc.). Voer de KESM Stack Processor tot verlichting artefact te verwijderen en de achtergrond intensiteit normaliseren in allebeelden. Herhaal dit voor alle gegevens submappen. Bereid meerschalige tegels uit de dataset en uploaden en het opzetten van de bestanden in de KESM Brain Atlas webserver. Zie Fig. 9. 7. Data visualisatie en analyse Visualisatie met behulp van de KESM Brain Atlas. Ga naar http://kesm.cs.tamu.edu en selecteer de gewenste atlas. Navigeren zoals bij Google maps. In-en uitzoomen als in Google maps. Als u naar een andere diepte, kiest u hoe diep je moet gaan op elke stap van het pull-down menu en klik vervolgens op beide [+] of [-] te verhogen of te verlagen z diepte. Stel de overlay nummer met behulp van het pull-down menu. Stel de overlay interval met behulp van het pull-down menu. Zie Fig. 11. Visualisatie met behulp van MeVisLab. De lancering MeVisLab. Maak een nieuw project. In de volgende, kunnen nieuwe modules worden creëren door Typing in de module naam in de opdracht vak. Maak een module [Compose3Dfrom2DFiles], en ga naar de gewenste map. Geef bestand string in en klik op in [GetFileList]. Zorg ervoor dat de geselecteerde beelden kunnen passen in het geheugen. Klik op [Create3D] om volume te creëren. Maak een module [SetWorldMatrix], en zet de "Scale" onder "Elementary transformaties" x, y, z om de juiste voxel grootte (0,6, 0,7, 1,0 voor een 10x 0.45NA doelstelling). Link [Compose3Dfrom2DFiles] op [SetWorldMatrix]. Stel Matrix en transformeert onder "Matrix Composition" naar "Negeren", "Negeer", "Forward". Maak een module [Arithmetic1] en stel de "Function" naar "Invert (Max-IMG)". Link [SetWorldMatrix] op [Arithmetic1]. Maak een module [View3D] en sluit [Arithmetic1]. In View3D, terwijl de rechter muisknop wordt ingedrukt, bewegen met de muis om de drempel aan te passen. U kunt bijsnijden regio's, wijzigen van de oriëntatie (beweeg muis terwijl de linker muisknop wordt ingedrukt), wijzigt u verlichting (volume rendering of MIP), aan / uit achtergrond, enz. Zie Fig. 10. 8. Representatieve resultaten: Hier presenteren we whole-brain gegevens en details. Vijgen. 12-15 tonen de hersenen als geheel India Ink, Golgi, en Nissl datasets 1, 4, 3. Figuur 1. Vast, gekleurd, en embedded hersenen van muizen Figuur 2. Embedded hersenen van muizen exemplaar gemonteerd op het monster ring. Figuur 3. The Knife Edge Scanning Microscoop (KESM). Een foto van de KESM wordt getoond met de belangrijkste componenten gemerkt: (1) hogesnelheidslijn-scan camera, (2) microscoop doelstelling, (3) diamant mes montage en licht collimator, (4) SPEcimen tank (voor onderdompeling in water beeldvorming), (5) drie-assige nauwkeurige air-dragende fase (6) wit-licht microscoop verlichting, (7) water pomp (in de rug) voor de verwijdering van de doorsnede weefsel, (8) PC-server voor podium-controle en beeld acquisitie, (9) granieten basis, en (10) graniet brug. Figuur 4. Imaging principes van de KESM. Het principe van de werking van KESM wordt geïllustreerd. Het doel en het mes is op zijn plaats gehouden, terwijl het monster aangebracht op de positionering podium beweegt (pijl met vaste lijn) op de resolutie van 20 nm en rijsnelheid van 1-5, en krijgt schraapte tegen de diamant mes (5 mm breed voor het 10X objectief), het genereren van een dunne gedeelte stroomt over het mes (pijl met vaste lijn). Line-scan beeldvorming wordt gedaan bij het uiterste puntje van het mes. Figuur 5. KESM camera en objectief scherpstellen controles. Figuur 6. KESM mes montage en controles. Figuur 7. Initial richten via de observatie-poort. Figuur 8. KESM Stage Controller 2 applicatie (screenshot). Figuur 9. KESM stack processor applicatie (screenshot). Figuur 10. MeVisLab applicatie (screenshot). <br/> Figuur 11 KESM Brain Atlas:. Web-interface (screenshot). Figuur 12. KESM de hersenen als geheel Oost-Indische inkt gegevens. Volume visualisaties van KESM gegevens stapels worden weergegeven voor de vasculaire data in te stellen. (A) Close-up van de vasculaire data. Breedte ~ 100 um. (Bd) Drie standaard uitzicht van de hele hersenen van muizen vasculatuur (subsampled van hoge-resolutie gegevens). Breedte ~ 10mm. Figuur 13. KESM whole-brain muis Golgi gegevens. Figuur 14. KESM Golgi data details. Figuur 15. KESM whole-brain Nissl data. (A) Close-up van de Nissl gegevens. ~ 300 um 3. (Bd) Drie standaard uitzicht van de hele hersenen van muizen Nissl gegevens (subsampled van hoge-resolutie gegevens). Doorsnede getoond voor een duidelijk beeld van de interne structuren.