עיון cytoskeleton אקטין ב לתאי אנדותל חיים הבעת GFP-אקטין
Summary
הדמיה מיקרוסקופית של תאים אנדותל לחיות להביע GFP-אקטין מאפשר אפיון של שינויים דינמיים מבנים cytoskeletal. שלא כמו טכניקות להשתמש דגימות קבוע, שיטה זו מספקת הערכה מפורטת של השינויים הזמני cytoskeleton אקטין בתאי אותו לפני, במהלך ואחרי גירויים פיזיים, תרופתי, או דלקתיים שונים.
Abstract
האנדותל כלי הדם ממלא תפקיד חשוב כמחסום סלקטיבי חדיר נוזלים מומסים. צמתים דבק בין לתאי אנדותל להסדיר החדירות של האנדותל, ומחקרים רבים הראו את תרומתו החשובה של cytoskeleton אקטין לקביעת שלמות junctional 1-5. חגורת אקטין קורטיקלי נחשב חשוב לשמירה על יציבות צמתים 1, 2, 4, 5. לעומת זאת, סיבי אקטין מתח נחשבים ליצור מתיחות בתוך צנטריפטלי ותאי האנדותל כי מחלישה צמתים 2-5. הרבה תיאוריה זו התבססה על מחקרים שבהם לתאי אנדותל מטופלים עם מתווכים דלקתיים ידוע להגדיל חדירות האנדותל, ולאחר מכן תיקנה את התאים תיוג F-אקטין להסתכלות מיקרוסקופית. עם זאת, מחקרים אלו מספקים הבנה מוגבלת מאוד של תפקיד cytoskeleton אקטין כי תמונות של תאים קבוע לספק תמונות בלבדזמן ללא מידע על הדינמיקה של מבנים אקטין 5.
Live-תא הדמיה מאפשר שילוב של האופי הדינמי של cytoskeleton אקטין לתוך המחקרים של מנגנוני קביעת שלמות מחסום אנדותל. היתרון העיקרי של שיטה זו הוא כי ההשפעה של גירויים דלקתיים שונים על מבנים אקטין בתאי אנדותל ניתן להעריך אותה קבוצה של תאים חיים לפני ואחרי טיפול, הסרת הטיה פוטנציאלית שעלולה להתרחש בעת התבוננות דגימות קבועות. האדם וריד הטבור לתאי אנדותל (HUVEC) הם transfected עם אקטין GFP-β פלסמיד וגדל מפגש על coverslips זכוכית. זמן לשגות תמונות של ה-GFP-אקטין ב HUVEC ומחוברות נלכדים לפני ואחרי תוספת של מתווכים דלקתיים כי לעורר תלוי זמן שינויים שלמות מחסום אנדותל. מחקרים אלה מאפשרים תצפית ויזואלית של רצף נוזל שינויים cytoskeleton אקטין שתורמים endotheliaאני שיבוש מחסום ושיקום.
התוצאות שלנו מראים בעקביות המקומי, אקטין עשיר היווצרות lamellipodia מחזור בתאי אנדותל. התהוות ותנועה של סיבי אקטין הלחץ יכול להיות גם ציין. ניתוח תדירות היווצרות מחזור של lamellipodia המקומית, לפני ואחרי הטיפול עם גירוי דלקתי יכול להיות מתועד על ידי מנתח רשם גלים. מחקרים אלו מספקים מידע חשוב על אופייה הדינאמי של cytoskeleton אקטין בתאי אנדותל שניתן להשתמש כדי לגלות המנגנונים המולקולריים מזוהה קודם לכן חשוב לשמירה על שלמות המחסום אנדותל.
Protocol
1. Transfection של HUVEC עם GFP-אקטין שיטות שונות שניתן להשתמש בהם כדי transfect HUVEC. המעבדה שלנו משתמשת מערכת Nucleofector (Lonza, Basel שוויץ) המפורטים להלן. באופן כללי, לעבוד במהירות כדי לשפר את כדאיות התא ויעילות transfection. Transfection לכל דורש 5 x 10 5 HUVEC יהיה זורעים על גבי שני coverslips זכוכית (Corning מס '1, 22 x 50 מ"מ). Nucleofector משלב electroporation ריאגנטים כימיים כדי transfect DNA פלסמיד, ובדרך כלל משיג יעילות הביטוי> 50%. ריאגנטים כימיים transfection הם שיטה חלופית. קבוצה אחת יש transfected בהצלחה לתאי אנדותל שור עם GFP-אקטין באמצעות ריאגנט GenePORTER 6. פרוטוקול Nucleofector נשתמש מתואר להלן. Coverslips cultureware או רגיל Presterilized ניתן להשתמש, בהתאם לסוג החדר. עבור coverslips זכוכית, לעקר במנדף בטיחות ביולוגי על ידי הצבת אותם לתוך צלחת 10 ס"מ תרבותהמכיל כ 5 מ"ל של אתנול 70% עבור 2 דקות. לאסוף אותם עם מלקחיים סטרילית אוויר יבש על ידי אותם נשען על הצד של צלחת תרבות נפרדת. יבש פעם, במקום כל coverslip בצלחת שלו 10 ס"מ תרבות. פיפטה μL 300 חרוז של פתרון ג'לטין חם (1.5% 0.9% NaCl) על מרכז coverslip ולאפשר לו לעמוד במשך 5 דקות. ולאחר מכן לשאוב. שמירה על זה ציפוי מטריקס במרכז, בלי לגעת בקצוות, תבטיח כי התאים יהיו זורעים בצפיפות ישיגו מפגש במהירות. הכן one 1.5 microfuge צינור מ"ל לכל transfection עם μL 500 של EGM2MV מדיה (Lonza) ומניחים בצד על 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2 באינקובטור. ניתוק HUVEC עם 0.25% טריפסין-EDTA ולאסוף לתוך צינור חרוטי 15 מ"ל. ספירת התאים. 5 x 10 5 תאים יש צורך transfection כל אחד. התאם את עוצמת ההשעיה תא להשיג גלולה שתכיל 5 x 10 5 תאים מוכפל במספר transfections להתבצע. צנטריפוגה ההשעיה תא בצנטריפוגה קליני בסל"ד 5000 למשך 3 דקות בטמפרטורת החדר. לשאוב supernatant על ידי הטיית הצינור להסיר התקשורת ככל האפשר. Resuspend גלולה עם פתרון Nucleofector בסיסי משני HUVEC או Primary תא האנדותל Nucleofector Kit (Lonza). השתמש 100 μL לכל 5 x 10 5 תאים. בשל הרעילות של פתרון זה, חשוב לעבוד במהירות תוך התאים מושעים בפתרון זה. מוסיפים את וקטור ה-GFP-β-אקטין פלסמיד (0.2-2 מיקרוגרם לכל μL 100 ההשעיה Nucleofector) המדגם transfection. 0.2-2 מיקרוגרם של ה-DNA-GFP אקטין הפלסמיד לכל 5 x 10 5 תאים לכל transfection. העברת 100 μL ההשעיה התא קובט Nucleofector. מכסים הברז קובט כמה פעמים כדי להבטיח את ההשעיה התא לאורך כל הדרך עד לתחתית. מניחים את קובט לחריץ Nucleofector קובט II המכשיר ולהפעיל את דelectroporation esired התוכנית. אנו משתמשים בתוכנית A-034 עבור HUVEC. החזר את קובט על מכסה המנוע את הבטיחות הביולוגית. תביאו את אחד הצינורות microfuge מ 37 ° C חממה המכיל 500 μL של EGM2MV אל מכסה המנוע. שימוש אחד של העברת pipettes המסופק בערכה Nucleofector, בעדינות להוסיף את μL חם 500 של התקשורת ההשעיה תא קובט. להעביר את כל התוכן של גב קובט אל הצינור microfuge מקום בחממה במשך 15 דקות. כדי לאפשר לתאים להתאושש. חזור על שלבים 9-11 כנדרש אם התאים יותר להיות transfected. אחת microfuge שפופרת המכילה 600 μL ההשעיה HUVEC transfected ניתן זורעים על גבי שני coverslips. תחת מכסה המנוע עם micropipette 1000 μL, פיפטה בעדינות מעלה ומטה פעם לערבב את ההשעיה, ולאחר מכן במקום 300 μL של ההשעיה ישירות על גבי coverslip ג'לטין מצופה. אל תתנו ההשעיה לגעת בקצה coverslip. מקום 37 ° CO 5 / 2% </sUB> חממה 1-4 שעות, כדי לאפשר התקשרות לתא. לאחר 1-4 שעות, לבדוק את התאים transfected לאשר להם המצורפת coverslip. לאחר מכן להוסיף 10 מ"ל של EGM2MV התקשורת, ולחזור אל צלחת 37 ° C / 5% CO 2 באינקובטור. GFP-אקטין ביטוי בדרך כלל ניתן להבחין בתוך 4-8 שעות. הניסויים מבוצעים בדרך כלל תוך 24-48 ח 2. הגדרת תא חי תאים הדמיה דוד הבמה רוב המחקרים שלנו, יש לנו מכשירים השתמשו וורנר לפתוח יהלום אמבטיה (RC22) להציב תנור PH 1-שלב, ניזונה מערכת זרימת כוח הכבידה. עם זאת, מספר אפשרויות זמינות עבור לחיות הדמיה בשלבים התא, כולל בתאי כי להתאים תחתית זכוכית תרבות מנות, חדרי פתוח לעומת סגור, שונים microincubator / מטרת שילובים דוד גדול במערכות חממה. בסופו של דבר, הבחירה קאמרית יהיה תלוי גורמים שונים, לרבות הצורך לגשת אמבטיה להוסיף סוכן בדיקה או תרופה, wheשם המדיום יהיה סטטי או תחת זרם, ואת אורך הניסוי. בנוסף, לפעמים גורמים כמו חוסר יציבות טמפרטורה יכול לגרום להיסחף להתמקד, ניתן למזער על ידי מערכות בקרה שיכול לשמור אמבטיה יציב בטמפרטורות אובייקטיבי. Aliquot בינוני מספיק בשביל הניסוי. אנו aliquot 50 מ"ל של תמיסת מלח פיזיולוגית אלבומין (APSS; טבלה 1) לכל שעת הניסוי יימשך. או מערכת משאבה או כוח המשיכה זרימת ניתן להשתמש כדי לספק בינוני לחדר. עבור המערכת שלנו, אנו מוסיפים APSS למערכת הכבידה זרימה פשוט בנוי מקו הזרימה תוך ורידי, המחובר דוד מוטבעת (וורנר מכשירים דגם SH-27A). אנו מיישמים תזרים של כ 40 mL / h. אם חדר האמבטיה פתוח כמו שלנו ישמש, למרוח משחה ואקום לקצה החיצוני על החלק התחתון של האמבט יהלומים עם המוליך כותנה שקצהו. לאחר מכן, אנו מקבלים תא אחד מכוסה coverslip מן האינקובטור, בעדינות להרים את coverslip באמצעות מלקחיים. Gently לגעת הישבן kimwipe כדי לספוג את עודף בינוני תוך שמירה על התא בצד מכוסה רטוב. עם התאים עם הפנים כלפי מעלה, במקום אמבטיה יהלום מעל coverslip כדי ליצור תא. במהירות למקום קאמרית לתוך התנור הבמה יד להדק את המלחציים על החדר. הדאגה העיקרית בשלב זה היא האפשרות כי התאים יתייבש. לכן חשוב לעבוד במהירות כאשר נעשה, מיד פיפטה ~ 1 מ"ל של מדיום לתוך החדר כדי למנוע את התאים מהתייבשות. החדר שלנו מאפשר זרימה קבועה של המדיום על פני התאים. רגע לפני הפעלת זרם, חשוב לצרף צינור ואקום לבעל שלה על החדר כדי לאפשר יציאה של המדיום תרבות עודף (APSS). תנור החימום ו מוטבעות אמבטיה צריך גם להיות מופעלת בשלב זה (עד 37 ° C). המערכת שלנו יש גם בדיקה thermistor לפקח על הטמפרטורה, אשר צריך להיות ממוקם על שפת האמבטיה. נגב בזהירות את החלק התחתון של שיתוףverslip עם kimwipe ספוגה EtOH 70% הנותרים להסיר התקשורת EGM2MV ואת הצטברות מלח. נגב בפעם השנייה עם kimwipe יבשה או נייר העדשה. לאחר קאמרית הוגדר, תזרים פועל, הטמפרטורה היא קבועה 37 ° C, לאפשר את התאים לפחות 30 דקות כדי לכוון ולייצב לפני תחילת הניסוי. בזמן ההמתנה, להפעיל את כל הרכיבים של מיקרוסקופ לחיות התא הדמיה (מנורות, בקר גלגל לסנן, מצלמה, מחשב). 3. רכישת נתונים עם מיקרוסקופ לחיות תאים הדמיה שונים לחיות מיקרוסקופיה מערכות תא זמינים. המערכת שלנו היא Eclipse Nikon TE-2000U עם הרכיבים הבאים: סאטר מכשירים Lambda LS 300 וואט קסנון מנורה סאטר מכשירים Lambda 10-3 גלגל עירור לסנן עם מסנן SmartShutter ו S492 (D350 ו – S572 מסננים exciter זמינים גם עבור יישומים UV ו RFP) Dichroic פולט 2002bs (ניקון 61002m) CI תוכנית פלואוריד Objective-DLL 10X, NA 0.30 (ניקון MRH10100) תוכנית פלואוריד ELWD המטרה DM 40X, NA 0.60 (ניקון MRH08420) תוכנית Apo VC 100x המטרה שמן, NA 1.40 (ניקון MRD01901) Photometrics CoolSNAP HQ2 המצלמה, 1040 x 1392 מערך הדמיה, 6.45 x 6.45 פיקסלים מיקרומטר (רופר מדעי) יש לנו גם שתי חבילות תוכנה שניתן להשתמש בהם עבור רכישת התמונה. Nikon AR-Elements 3.0, 6.1 ו Metamorph. לאחר הצגת תאים למצוא שטח מתאים המחקר, לנעול את הכפתור להתמקד גס לבדוק את רכישת התוכנה ההגדרות כך: גלגל המסנן מוגדר עבור המסנן S492 (שכותרתו "FITC" בתצורת שלנו) ב התוכנה הרכישה, המטרה היא להגדיר כדי להתאים את ההגדלה הרצוי (מיקרוסקופ שלנו לא ממונע, אבל זה מגדיר את היחס מיקרומטר / פיקסל). כמו כן, לוודא כי העדשה optivar על המיקרוסקופ מוגדר הגדלה 1.0X. הגדרת optivar כדי 1.5x עשויה להגדיל הגדלה, אך על חשבון איבוד עוצמת האות. הגדלה לשמש תלוי המטרות של המחקר. לפרטים הטוב ביותר, מטרה 100x עם צמצם מספרית גבוהה תספק את הרזולוציה המרחבית הטובה ביותר להעברת אות. מיקרוסקופ שלנו מצויד גם המטרה למרחקים ארוכים עבודה 40X מיועד יישום אחר הדורש את המרחק הנוסף. עם זאת, מטרה זו יכולה להיות שימושית כאשר אנו רוצים לבחון מספר תאים במקביל, עובד מצוין לצפייה אברון בגודל המבנים, אך במחיר של אובדן רזולוציה מרחבית ועוצמת האות. לצורך המחקר כלשהו שבו עוצמת האות היא נקודת הסיום, או יותר בטכניקות הדמיה מתקדמות כגון פלואורסצנציה מיקרוסקופ רבב, מטרה 100x מומלץ. זמן החשיפה המצלמה מוגדר בין 0.5-2 s. זה תלוי בעוצמת ה-GFP-אקטין בתאים. אנו משתמשים בדרך כלל את זמן החשיפה הנמוכה ביותר האפשרית כדי למנוע bleaching של אקטין-GFP ואת פוטנציאל רעילות לתאים. כדי להשיג את הפתרון הטוב ביותר, binning צריך להיות מוגדר על 1 x 1 ולהשיג בבית 1. במקרים מסוימים שהצבנו binning עד 2 x 2 כדי לצמצם את זמן החשיפה, אך זה מפחית את רמת הדיוק של המדידות אנחנו יכולים לעשות על אובייקטים נעים במחקר זמן לשגות. הגדר את זמן לשגות הגדרות: בחר את התיקייה כדי לשמור את התמונות שנתפסו וסוג הקובץ. קבע את מספר התמונות ואת משך פעמים במרווח לצורך הניסוי. אנו משתמשים בדרך כלל מרווח של 15 דקות עד 1 בין דמויות ועד 2 שעות למשך. ודא כי תריס פעילה מוגדר להיות סגור בין רכישות. לפני תחילת זמן לשגות רכישת התמונה, לכבות את האורות בחדר ללכוד תמונה אחת כדי לבדוק את ההגדרות. גם ללכוד תמונה brightfield. ודא הקבל מוגדר בשלב הנכון או לסנן DIC. להדליקמנורת הלוגן ולאסוף את התמונה. כבה את מנורת הלוגן. לחזור להגדרות "FITC" הדמיה זמן לשגות ו ללכוד תמונה מבחן. צלמו את הסדרה זמן לשגות. במהלך הניסוי, חשוב לנטר את התמונות כפי שהם רכשו. במקרים מסוימים שינויים קטנים בטמפרטורה בתוך החדר עלול לגרום להיסחף להתמקד. זה יכול להימנע על ידי אופטימיזציה של יבוא קווי ואקום כך כי תזרים יציב לאורך התאים. כמו כן, מזעור תנועה בחדר מיקרוסקופ, ואת הפניית טיוטות של פתחי אוורור בתקרה הרחק המיקרוסקופ יכול להיות מועיל. חלופה כי עבד היטב הניסיון שלנו הוא השימוש של 37 ° C / 5% CO 2 חדרי חממה התוחמים את הבמה המטרה כולה. אלה מציעים את היתרון של התאים ניטור לילה או יותר, אבל הגישה התאים מוגבל. במידת הצורך, להשהות את רכישת זמן לשגות ולמקד את התמונה. בצע את להתרכז כמה שיותר מהר כדי להימנע לשנות את מרווח הזמן בין התמונות. פרוטוקול טיפוסי יכלול 20-30 דקות של תמונות הבסיס לפני הוספת סוכן מבחן ואחריו 0.5-4 שעות של רכישת תמונה נוספת. אורכו של הניסוי יכולה להיות מוגבלת על ידי photobleaching של ה-GFP לאורך זמן, ולכן חשוב לבחור את זמן החשיפה הקצר ביותר האפשרי. זה יכול להיות גם רצוי כדי לשנות את המרווח בין התמונות לשגות זמן של 30-60 אם מחקר ארוך הוא הרצוי. 4. ניתוח נתונים כמה חבילות תוכנה ניתן להשתמש כדי לנתח את מערכות תדמית, כגון אלמנטים ש"ח, Metamorph, Slidebook, וכו 'אנחנו בדרך כלל לבצע ניתוח התמונה שלנו באמצעות NIH ImageJ המאפשר ניתוח בכל מחשב במעבדה שלנו או בבית. גרסאות אנו משתמשים הם: MBF ImageJ ( http://www.macbiophotonics.ca/imagej/ ) פיג'י (אני "target =" _blank "> http://pacific.mpi-cbg.de/wiki/index.php/Fiji). ImageJ ניתן להשתמש כדי לנתח תהליכים דינמיים רבים, כולל: תדירות בליטות lamellipodia מרחק, זמן, מהירות של בליטות סיב אקטין תנועה לאורך זמן אלמנטים Nikon חוסך זמן לשגות תמונות כמו קובץ "ND". כדי לפתוח ImageJ זה צריך להיות מומר סדרה TIF באמצעות "ND לייצא מסמך" תכונה. ערימות Metamorph התמונה ניתן לפתוח ImageJ ללא שינוי. אפשרות אחת שאנחנו בוחרים בעת פתיחת סדרת TIF ב ImageJ היא להמיר של 8 סיביות בגווני אפור. זה הופך את הצפייה יותר קל כי התאמות הבהירות והניגודיות יחולו על הסדרה כולה ולא תמונה בודדת להיות שנצפו. ב ImageJ, כאשר להגדיר תמונה פותחת את מספר פרוסה / פרוסות הכולל יוצג בפינה השמאלית העליונה של החלון, יחד עם שם הקובץ, מספר פיקסלים, סוג הקובץ, גודל. Z גלילה בתחתית המתאים בזמן. בנוסף, מרחפת את המצביע על התמונה תציג את x, y, z ומיקום פיקסל בחלק התחתון של סרגל הכלים ImageJ. בליטה Lamellipodia ניתן ללמוד על ידי קביעת מספר בליטות חדש לאורך זמן. ניתן לעשות זאת עבור למתחם התא כולו או האזור הנבחר. סוג זה של ניתוח יכול גם להתבצע, תאים nonconfluent untransfected עם ניגודיות שלב או מיקרוסקופיה DIC. עם זאת, שימוש בתאים לבטא את ה-GFP-אקטין מאפשר ניתוח של monolayers ומחוברות, במיוחד כאשר התאים המכילים וחסרת GFP-אקטין הם סמוכים זה לזה. המרחק Lamellipodia בליטה, התמדה (זמן), ומהירות ניתן להעריך על ידי ניתוח (קו סריקה) רשם גלים. צייר קו מאונך לקצה של תא (זוהי הקלה אם אין תאים סמוכים, או תאים סמוכים לא להביע GFP-אקטין). ב ImageJ, לחיצה על "/" יפיק רשם גלים, עם ציר ה-x המייצג דistance והזמן ציר y בייצוג (15 דק 's ל 1 לפיקסל על פי מרווח הזמן הנחיות לעיל). קווי ניתן להסיק על lamellipodia בולטות הממדים תיבת נמדד (על ידי לחיצה על M ב ImageJ). מרחק, זמן, מהירות יכול להיות מחושב. התנועה של סיבי סטרס יכול להיות גם נמדד על ידי ניתוח רשם גלים באופן דומה. 5. נציג תוצאות: עם פרוטוקול transfection שלנו, אנו בדרך כלל לראות את ההבעה של ה-GFP-אקטין ב 50% לפחות של HUVEC transfected, ולעתים קרובות אפשר למצוא אזורים על coverslip שבו> 90% HUVEC באזור להביע GFP-אקטין. דוגמה של ניסוי הדמיה תא חי עם HUVEC subconfluent להביע GFP-אקטין מוצג סרט 1. לצורך ניסוי זה בפרט, התמונה נרכשה אחת לדקה. כפי שניתן לראות בסרט, GFP-אקטין ב HUVEC ניתן לצפות בכל הציטופלסמה, כמו גם struct פילמנטיותures וב lamellipodia המקומי בולטות בשולי התא. ניכר גם בסרט זה GFP-אקטין הביטוי אינה אחידה בין התאים. תאים שנבחרו למחקר בדרך כלל יש מספיק GFP-אקטין הנוכחי כדי להמחיש מבנים שונים המכילה אקטין פילמנטיות. תאים להביע רמות גבוהות מאוד של ה-GFP-אקטין יכול להיות בעייתי למחקר, כי בתאים אלו הוא בדרך כלל קשה להבחין בין F-אקטין מבנים גבוהים מהסכום הנוכחי של ה-G-אקטין. סרט 2 מציג דוגמה של התנהגות HUVEC ומחוברות להביע GFP-אקטין. כמו HUVEC subconflent, פעיל היווצרות lamellipodia מחזור לאורך היקפה של התאים היה ברור. עם זאת, לעתים קרובות lamellipodia אלה הולידה קרום סלסולים, המציין בליטה פחות יעיל 7. זה כנראה בשל נוכחותם של תאים סמוכים חסימת תשתית בקרבת מקום. סיבי אקטין קליפת המוח וסיבים מתח גם גלויה סרטים 1 ו 2. למרות התאים אנו observed נשאר נייח, סיבי מתח דומים סיבים קשת רוחבי תאים נודדים, יוצרים סמוך לקצה התא נע רוחבית לכיוון מרכז התא שבו הם לפרק 8, 9. תכונה דינמית נוספת נצפתה בתאים אלה היה היווצרות של מבנים אקטין טבעת מורחבת מעגלי, בעבר בשם אקטין עננים 10. דוגמה של איך, מרחק התמדה, ומהירות של בליטות סלולריים הם לכמת מהתמונה זמן לשגות אלה קובע באמצעות ניתוח רשם גלים מוצג באיור 1. באיור 1A, הקו פיקסל אחד נמשך בערך בניצב קצה התא עבור הדור של רשם גלים (איור 1B). ב רשם גלים זה, באזור המוגדר על ידי קו ממוקם אנכית את התמונות מכל רחבי לשגות-הזמן נערמים אופקית. במבט משמאל לימין ב רשם גלים, בליטות מיוצגים התנועות כלפי מעלה בקצה התא. באיור 1C, קו היה superimposed על קצה אחד של בליטות אלה, והנתונים פיקסל הקשורים קו נאספו מוצגים בחלון התוצאות בתחתית הפאנל. ניתוח זה מאפשר כימות של דינמיקה בליטה, והוא יכול לשמש גם כדי להעריך את שכיחות בליטה (מספר בליטות / שעה) באזור זה של התא. דוגמה של ניתוח התנועה סיבים מתח מוצג באיור 2. סיבי סטרס רוב צפינו נוצרו ליד בפריפריה התא והתקדם אל מרכז התא, שם הם מפורקים בסופו של דבר. זה יכול להיות גם לכמת ידי ניתוח רשם גלים. קו מצויר ניצב בקצה התא של סיבי סטרס (איור 2 א) וכן רשם גלים נוצרת (תרשים 2B). הסיבים מופיעים קווי מתח מתמשך באזור cytoplasmic ב רשם גלים, לעתים קרובות נע למטה ימינה (לכיוון מרכז התא). לפעמים הסיבים קשה לראות רשם גלים המקורי, במקרים אלה אנולהשתמש במסנן unsharp מסכה כדי לחדד את התמונה (איור 2C). קווים נמשכים על סיבים מתח הנתונים פיקסל נאספים באמצעות הפונקציה למדוד (איור 2 ד). דרך חלופית כדי לאסוף נתונים אלה היא למתוח קו מההתחלה ועד הסוף של סיבים הלחץ זיהו כדי לקבל את השיפוע הממוצע למשך כי סיבים נצפתה (2E איור). ניתוח זה מאפשר כימות של התנועה מתח סיב לרוחב יכול לשמש גם לכמת את מספר סיבי מתח נצפו באזור זה של התא. באיור 1. ניתוח רשם גלים של קצה התא כדי לקבוע את המרחק בליטה, התמדה, ומהירות של lamellipodia המקומית.. קו פיקסל בודד נמשך בערך בניצב לקצה של התא. אזור זה מופק כל תמונה של פקיעה, המועד שנקבע כדי ליצור מונטאז' של האזור לאורך זמן. B. במאות הדואר וכתוצאה מכך רשם גלים, את ציר X מייצג זמן, נע משמאל לימין, ואת ציר y מראה מרחק. תנועת קצה התא לאורך זמן ניתן להעריך רשם גלים זה, lamellipodia מזוהים אזורים שבהם קצה התא, נע ימינה, הולך כלפי מעלה. ג. קו מצויר על קצה התא שבו בליטה על ידי lamellipodium זוהה. מידות המלבן תוחמת עבור הקו נמשך נרכשים אז (מוצג בחלון גבי). רוחב משמש כדי לחשב את זמן בליטה או התמדה. גובה משמש כדי לחשב את המרחק בליטה. מהירות בליטה מחושב על ידי חלוקת גובה על ידי רוחב. בדוגמה זו, המרחק היה מעלה 96 פיקסלים x 0.16125 מיקרומטר / פיקסל = 15.5 מיקרומטר, והזמן היה 11 פיקסלים x 1 מינימום / פיקסל = 11 דקות. מהירות חושבה כמו μm/11 15.5 דקות. = 1.4 מיקרומטר / min. Figure 2. רשם גלים ניתוח התנועה של סיבי אקטין הלחץ.. קו פיקסל בודד מופנית בניצב לקצה של התא כדי ליצור רשם גלים. B. כפי שמוצג באיור. 1, רשם גלים שהתקבל, את ציר X מייצג את הזמן ואת המרחק ציר y. סיבי סטרס הם נצפו כקווים רציפה בתא, לעתים קרובות הולך כלפי מטה ימינה (החצים) ג. כדי להמחיש טוב יותר את סיבי מתח, מסנן את המסכה unsharp ניתן להשתמש. בדוגמה זו, ברדיוס של 3 פיקסלים ומשקל של 0.60 מסכה היה בשימוש. ד. קווי פיקסל בודד נמשכים ואז על סיב הלחץ שזוהו, ואת הנתונים שנאספו. בלוח זה שלושה קווי נמשכו ואז "למחוק" נלחץ לעשות ביאור קבוע (קו לבן) של מיקומם לאחר כל מדידה. E. לחלופין, אם המרחק הזמן הממוצע, ומהירות של סיבים הלחץ הרצוי, קו ניתן להסיק מן ההתחלה ונקודות הסיום (קו צהוב), והנתונים עבורr כי ניתן לרכוש (מסומן בחלון התוצאות). בדוגמה זו, המדידות נעשו על סיב זה הלחץ של 37 מסגרות x 1 דקות מסגרת /. = 37 דקות. המרחק נסע מעל פרק זמן זה היה 75 מסגרות x 0.16125 מיקרומטר / פיקסל = 12.1 מיקרומטר. מהירות לרוחב הסיבים וכתוצאה מכך הלחץ היה 12.1 μm/37min = 0.33 מיקרומטר / min. ערך חיובי עבור מהירות מוקצה עבור סיבים נע לכיוון מרכז התא שלילי סיבים לנוע לכיוון הפריפריה. תמונות סרט 1. זמן לשגות של HUVEC לחיות להביע GFP-אקטין. מרווח הזמן בין התמונות הוא 1 דקות. מקומי lamellipodia שבלט לאורך המערכת כולה של תאים. בנוסף, מתח רוחבי סיבים קשת עברה רוחבית לכיוון מרכז של תאים. כאשר תרומבין (1 U / ml) נוספה באמבטיה, התאים הצטמצם מעט ואת בליטות כלפי חוץ של lamellipodia עצר על 10 דקות. אחרי התאים נדבק, היווצרות lamellipodia מחזור קורות חיים ד לחץ כאן כדי לראות את הסרט. סרט 2. HUVEC ומחוברות להביע GFP-אקטין, לפני ואחרי הטיפול עם תרומבין. זמן שחלף מוצג בפינה הימנית התחתונה כמו שניות: דקות. מרווח הזמן בין התמונות הוא 30 s. טרומבין (1 U / ml) נוספה לאחר 45 דקות. תקופת המחקר. האירועים כוללים מוער המקומית היווצרות lamellipodia מחזור (ראשי חץ ליד קצוות התא, 0:59 – 37:29), אקטין עננים (חיצים, 1:59-21:29), ואת פער בצומת tricellular כי מתרחב לאחר תרומבין נוסף (חץ, 62:30 – 70:00). רוחבי להדגיש סיבי קשת גם ניכר מספר של התאים. התאים מוצג היווצרות מחזור פעיל של lamellipodia המקומית לאורך היקפה שלהם, עם הרבה והוליד קרום סלסולים. טרומבין גרם הפסקה במבנה lamellipodia מחזור, ואת המראה קצרה של כמה פערים קטנים בין התאים.http://www.jove.com/files/ftp_upload/3187/Movie2-confluentHUVEC.avi "> לחץ כאן כדי לראות את הסרט.
Discussion
הדמיה של ה-GFP-אקטין בתאי אנדותל לחיות מאפשר ניתוח מפורט של הדינמיקה של cytoskeleton אקטין בתגובה לגירויים דלקתיים. שיטה זו עשויה להיות שימושית גם לבנות על ממצאים קודמים מראה שיפוץ cytoskeleton בתגובה כוחות פיזיים כמו מתח גזירה 11. בנוסף, שיטה זו מאפשרת הערכה מפורטת של התרומה של הדינמיקה אקטין cytoskeletal על פעילויות שונות תא האנדותל, כולל הגירה, מיטוזה, היווצרות של צמתים אינטר והתבגרות junctional, תפקוד ותחזוקה של המכשול.
ב הנתונים המוצגים, התנהגותם של cytoskeleton אקטין אנדותל ניתן לראות לפני ואחרי הטיפול עם תרומבין. Lamellipodia מקומי כל בשולי לתאי אנדותל נצפו להרכיב רגרסיה לאורך זמן monolayers התא הן nonconfluent ומחוברות. טיפול עם תרומבין בקצרה קטע טופס lamellipodiaation מחזור. טרומבין גם גרמה לתאים להתכווץ מעט, בהסכמה עם דיווחים קודמים כי תרומבין גורמת ללחץ סיבי אקטין היווצרות מתח מוגבר להתפתחות צנטריפטלי בתאי אנדותל 12-14. עם זאת, מן המחקרים תא חי הדמיה כגון זה, מקורם של הסיבים הלחץ כעת ניתן נחוש. ב HUVEC, רוב הסיבים מתח מקורן בשולי התא דומה סיבי קשת רוחבי של תאים נודדים 8, 9. כוח נוסף של שיטה זו על פני שימוש בתאים קבועים שמספר סיבי המתח ניתן לכמת בתאים בודדים לפני ואחרי הטיפול תרומבין, ביטול הטיית בחירה בין קבוצות הניסוי.
באמצעות פרוטוקול זה אנו מעריכים תנועה דינמית של קצה תא הלחץ סיבי אקטין. כדי להבין את הדינמיקה מונומר אקטין בתאי אנדותל, טכניקות מתקדמות יותר כגון התאוששות הקרינה לאחר photobleaching (FRAP) או פלואורסצנטי רבב מיקרועותק (FSM) יכול להיות מיושם 15, 16. בנוסף, בגלל כלי הדם לתאי אנדותל יכול לייצג מודל טוב יותר של תפקוד מחסום כלי הדם, אופטימיזציה של פרוטוקולים transfection לבטא בצורה יעילה GFP-אקטין בתאי אנדותל כלי הדם מייצג הכיוון העתידי הגיוני.
לסיכום, הדמיה של בתאי האנדותל לחיות להביע GFP-אקטין מהווה כלי רב עוצמה כדי לקבוע כיצד cytoskeleton אקטין תא האנדותל מגיב סוגים שונים של גירויים. מחקרים באמצעות monolayers אנדותל ומחוברות היטב תסייע לקבוע את התפקידים של מבנים דינמיים כגון אקטין עשיר lamellipodia ו רוחבי מתח קשת סיבים בתפקוד האנדותל מחסום. בנוסף, הדמיה של תא חי לתאי אנדותל להביע GFP-אקטין או חלבונים היתוך אחרים המאפשרים הדמיה של מבנים subcellular אחרים יספק מידע spatiotemporal מפורט כדי להבין את מנגנוני איתות מבניים דetermine שלמות המכשול.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
GFP-β-אקטין פלסמיד סופק בנדיבות על ידי ד"ר ווין אור, LSUHSC-S המחלקה לפתולוגיה, והיה מוגבר במעבדה של ד"ר בקי Worthylake, LSUHSC-NO המחלקה לפרמקולוגיה. עבודה זו נתמכה על ידי מענקים מהמוסד הלאומי לבריאות (P20 RR-018766) ואת איגוד הלב האמריקני (05835386N).
Materials
| 1. Ringer 5x Stock | |||
| Chemical | Company | Catalog Number | Amount |
| Sodium Chloride | EMD | SX0420-3 | 35 g |
| Potassium Chloride | J.T. Baker | 3040 | 1.75 g |
| Calcium Chloride | Sigma | C-3881 | 1.47 g |
| Magnesium Sulfate | Sigma | M-9397 | 1.44 g |
| Sterile Filtered Water | N/A | N/A | Bring to 1 L |
| Sterile filter into autoclaved bottles and stores at 4°C | |||
| 2. MOPS buffer | |||
| Chemical | Company | Catalog Number | Amount |
| MOPS | Sigma | M3183 | 125.6 g |
| Sterile Filtered Water | N/A | N/A | Bring to 1 L |
| Sterile filter into autoclaved bottles and stores at 4°C | |||
| 3. Albumin Physiological Salt Solution (APSS) | |||
| Chemical | Company | Catalog Number | Amount |
| Ringer stock (5x) | N/A | N/A | 200 mL |
| Mops Buffer | N/A | N/A | 5 mL |
| Sodium Phosphate | Sigma | S-9638 | 0.168 g |
| Sodium Pyruvate | Sigma | P5280 | 0.22 g |
| EDTA sodium salt | Sigma | ED2SS | 0.0074 g |
| Glucose | Sigma | G7528 | 0.901 g |
| Albumin, Bovine | USB | 10856 | 10 g |
| Sterile Filtered Water | N/A | N/A | Bring to 1 L |
| Adjust pH to 7.4 at 37°C, then sterile filter into autoclaved bottles and store at 4°C. | |||
| 4. 0.9% Saline | |||
| Chemical | Company | Catalog Number | Amount |
| Sodium Chloride | EMD | SX0420-3 | 9 g |
| Sterile Filtered Water | N/A | N/A | Bring to 1 L |
| Sterile filter into autoclaved bottles and stores at 4°C | |||
| 5. 1.5 % Gelatin Solution | |||
| Gelatin from porcine skin | Sigma | G2500 | 15 g |
| 0.9% Saline | N/A | N/A | Bring to 1 L |
| Warm the solution to 37°C to dissolve gelatin sufficiently. While still warm, sterile filter into autoclaved bottles and store at 4°C | |||
References
- Spindler, V., Schlegel, N., Waschke, J. Role of GTPases in control of microvascular permeability. Cardiovasc. Res. 87, 243-253 (2010).
- Wojciak-Stothard, B., Ridley, A. J. Rho GTPases and the regulation of endothelial permeability. Vascul. Pharmacol. 39, 187-199 (2002).
- Yuan, S. Y. Signal transduction pathways in enhanced microvascular permeability. Microcirculation. 7, 395-403 (2000).
- Birukov, K. G. Small GTPases in mechanosensitive regulation of endothelial barrier. Microvasc. Res. 77, 46-52 (2009).
- Duran, W. N., Sanchez, F. A., Breslin, J. W., Tuma, R. F., Duran, W. N., Ley, K. Microcirculatory Exchange Function. Handbook of Physiology: Microcirculation. , 81-124 (2008).
- Hu, Y. L., Chien, S. Dynamic motion of paxillin on actin filaments in living endothelial cells. Biochem. Biophys. Res. Commun. 357, 871-876 (2007).
- Borm, B., Requardt, R. P., Herzog, V., Kirfel, G. Membrane ruffles in cell migration: indicators of inefficient lamellipodia adhesion and compartments of actin filament reorganization. Exp. Cell. Res. 302, 83-95 (2005).
- Hotulainen, P., Lappalainen, P. Stress fibers are generated by two distinct actin assembly mechanisms in motile cells. J. Cell. Biol. 173, 383-394 (2006).
- Pellegrin, S., Mellor, H. Actin stress fibres. J. Cell. Sci. 120, 3491-3499 (2007).
- Ballestrem, C., Wehrle-Haller, B., Imhof, B. A. Actin dynamics in living mammalian cells. J. Cell. Sci. 111, 1649-1658 (1998).
- Helmke, B. P., Rosen, A. B., Davies, P. F. Mapping mechanical strain of an endogenous cytoskeletal network in living endothelial cells. Biophys. J. 84, 2691-2699 (2003).
- Birukova, A. A., Smurova, K., Birukov, K. G., Kaibuchi, K., Garcia, J. G., Verin, A. D. Role of Rho GTPases in thrombin-induced lung vascular endothelial cells barrier dysfunction. Microvasc. Res. 67, 64-77 (2004).
- van Nieuw Amerongen, G. P., van Delft, S., Vermeer, M. A., Collard, J. G., van Hinsbergh, V. W. Activation of RhoA by thrombin in endothelial hyperpermeability: role of Rho kinase and protein tyrosine kinases. Circ. Res. 87, 335-340 (2000).
- Moy, A. B., Blackwell, K., Kamath, A. Differential effects of histamine and thrombin on endothelial barrier function through actin-myosin tension. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 282, H21-H29 (2002).
- Wittman, T., Littlefield, R., Waterman-Storer, C., Goldman, R. D., Spector, D. L. Fluorescent speckle microscopy of cytoskeletal dynamics in living cells. Live Cell Imaging: A Laboratory Manual. , 184-204 (2005).
- Rabut, G., Ellenberg, J., Goldman, R. D., Spector, D. L. Photobleaching techniques to study mobility and molecular dynamics of proteins in live cells: FRAP, iFRAP, and FLIP. Live Cell Imaging: A Laboratory Manual. , 101-126 (2005).
Cite This Article
Doggett, T. M., Breslin, J. W. Study of the Actin Cytoskeleton in Live Endothelial Cells Expressing GFP-Actin. J. Vis. Exp. (57), e3187, doi:10.3791/3187 (2011).