Isolamento di cellule CD133 + staminali del fegato per l'espansione clonale

Tutti, media soluzioni, strumenti, filtri, tubi e devono essere sterili e trattati con una tecnica sterile per ridurre il rischio di contaminazione. Preparare tutti i tamponi ei media 24 ore di anticipo e conservare a 4 ° C. 1. Separazione parenchimale e non-parenchimali di fegato intero Preparare la soluzione enzimatica per la digestione con un tubo di 15 cc con tappo a vite in 10 ml di PBS sterile contenente 5 mg di collagenasi, 5 pronasi mg e 1 mg DNAsi. Euthanize mouse utilizzando istituto approvato (Cura degli animali e del Comitato Istituzionale Usa) metodo come CO 2 asfissia. Pulire zona addominale eutanasia di animali con una soluzione di etanolo al 70%. Utilizzando gli strumenti sterili, cavità addominale aperta e fegato espianto en-blocco. Rimuovere cistifellea dal fegato espiantato. Trasferimento di fegato intero cappa a flusso laminare in ambienti chiusi piatto sterile. Questa procedura viene completata in una cappa a flusso laminare. Utilizzando una lama di rasoio sterile, tritare fegato con la combinazione di diversi tagli orizzontali e verticali per 1 minuto nel piatto sterile. Luogo ¼ di polpa tritata di fegato in 15 tubi cc con 10 cc PBS con collagenasi, pronasi, e DNAsi dal punto 1.1. Ripetere con ogni ¼ fegato tritato. Tubi posto con ¼ polpa tritata e enzimi epatici in bagno d'acqua a 37 ° C per 45 minuti, con agitatore a 1-2 cicli / secondo. Pulire i tubi con etanolo al 70% dopo la rimozione da bagno di acqua prima del trasferimento a cappuccio a flusso laminare. Questa procedura viene completata in una cappa a flusso laminare. Ceppo polpa fegato digerito a 70 micron a rete per raccogliere in un piatto sterile. Utilizzando 2 ml di DMEM sterile: F12 media con il 10% inattivato con il calore siero fetale bovino, lavare il filtro e utilizzare il terminale in gomma di una stantuffo della siringa per schiacciare la polpa digerito attraverso il filtro. Ripetere 5 volte per fare volume complessivo di circa 20 ml di filtrato. Dividere il filtrato in 2 pari provette da 15 ml. Tutti i trasferimenti dovrebbero essere completati in cappa a flusso laminare, e l'uso centrifuga refrigerata a 4 ° C, se disponibile. Centrifugare a 50 g per 1 minuto. Salva surnatante # 1 e scartare parenchimale pellet. Centrifuga surnatante # 1 a 50 g per 1 minuto. Salva surnatante # 2 e scartare pellet. Centrifuga surnatante # 2 a 50 g per 1 minuto. Salva surnatante # 3 e scartare pellet. Centrifuga surnatante finale # 3 per 180 g per 8 minuti a ottenere non frazione parenchimale. 2. Lisi delle cellule rosse Lavori in cappa a flusso laminare, celle frigorifere mantenere, utilizzare e soluzioni raffreddato a 4 ° C. La notte prima della procedura, preparare rosso buffer di lisi cellulare diluendo 10 volte la concentrazione magazzino BD Pharm Lyse buffer con una diluizione 1:10 con acqua distillata sterile. 1X solutionshould essere conservato per 30 giorni a 4 ° C. La notte prima della procedura, preparare tampone Miltenyi con PBS sterile, 0,5% di BSA, e 2mM EDTA. Filtro soluzione con unità filtro vuoto con filtro da 0,45 micron. Coperchio superiore dell'unità ribaltatore con coperchio in plastica originale e sicuro con involucro di plastica. Storeentire unità filtro a 4 ° C per 12 ore a Degas EDTA. Unità filtro può essere sostituito con lo standard tappo sterile dopo 12 ore. Questa procedura viene completata in una cappa a flusso laminare. Utilizzando una provetta da 5 ml sterili, risospendere non parenchimali pellet da 1,6 passo sopra in 1 ml di 1X diluito rosso tampone di lisi delle cellule del sangue da 2.1. Chiudere la provetta per il trasferimento fuori della cappa a flusso laminare. Delicatamente vortex per 5 secondi e incubare per 15 minuti a 4 ° C al riparo dalla luce. Centrifugare a 200 xg per 5 minuti. Questa procedura viene completata in una cappa a flusso laminare. Gettare globuli rossi lisati in surnatante e risospendere pellet in 1 ml di tampone di ghiaccio freddo e sterile Miltenyi. Centrifugare a 200 xg per 5 minuti. Questa procedura viene completata in una cappa a flusso laminare. Gettare il surnatante e risospendere il pellet in 1 ml di tampone di ghiaccio freddo e sterile Miltenyi. Rimuovere 10 ml di sospensione cellulare PBS e aggiungere 10 microlitri tryan blu. Conte remainingnon-cellule parenchimali con emocitometro. 3. CD45 deplezione delle cellule ematopoietiche da non-frazione parenchimale Lavori in cappa a flusso laminare, celle frigorifere mantenere, utilizzare e soluzioni raffreddato a 4 ° C. Sospendere le cellule in 100 ml di buffer di Miltenyi per 107 cellule fino a 108 cellule totali. Applicare 20 l Miltenyi anticorpo CD45 microbead per ogni 107 cellule e incubare a 4 ° C per 15 minuti. Aggiungere altri 2 ml di buffer Miltenyi e centrifugare a 200 xg per 5 minuti. Rimuovere il surnatante. Risospendere il pellet cellulare (fino a 108 cellule totali) in 1 ml di tampone Miltenyi. Nella cappa a flusso laminare, celle filtranti con Miltenyi colonna magnetica LD. Inizio mettendo colonna in supporto magnetico (MidiMACS Miltenyi o QuadroMACS). Luogo sterile 5 ml di tubo sotto il filtro per catturare filtrato. Preparare colonna caricando 2 ml Miltenyi buffer. Una volta pre-filtro lavaggio è completo, celle di carico sulla colonna LD. Una volta che la sospensione cellulare è all'interno della colonna, aggiungere 1 ml di tampone Miltenyi e ripetere 1 ml Miltenyi tampone di lavaggio 2 volte aggiuntivi. NON utilizzare stantuffo dotato di colonna per aumentare la velocità di filtrazione. SOLO raccogliere filtrato quando il filtro posto nel supporto magnetico. Centrifugare il filtrato raccolto di circa 5 ml (la colonna detiene il restante 1 ml) di CD45-impoverito non le cellule parenchimali a 200 xg per 5 minuti. Eliminare la colonna con le cellule CD45 mantenuto positivo. 4. Citometria a flusso isolamento di cellule CD133 positive Preparare i media cellule ovali. Usa 01:01 DMEM: F12 media con il 10% di siero fetale inattivato vitello calore come base e aggiungere insulina (1 mg / ml), HEPES (5 mol / L) e penicillina / streptomicina (1% volume / volume). Filtro soluzione con unità filtro vuoto con filtro da 0,45 micron. Risospendere le cellule nel buffer Miltenyi a 100 l per 10 7 cellule. Aggiungere 2 ml di CD133-PE anticorpi coniugati. Utilizzando un secondo gruppo di cellule, incubare con IgG-PE coniugato come controllo. Mantenere un terzo gruppo di cellule senza colorazione come un controllo senza macchia per FACS. Incubare a 4 ° C per 15 minuti al buio. Risospendere in 2 ml di tampone colorazione. Centrifugare a 200 xg per 5 minuti. Gettare il surnatante e risospendere il pellet in 1 ml di tampone Miltenyi. Questo passo è eseguiti utilizzando le normali procedure di citometria a flusso separazione delle cellule, che può essere specifico istituto. Utilizzando cellule senza macchia e IgG cellule PE macchiato, regolare i parametri per l'ordinamento gating ottimizzata di popolazione di cellule CD133 +. PE (R-Phytoerythrin) può generalmente essere utilizzato con qualsiasi citofluorimetro che ha un laser che emette a 488 nm. Il picco di emissione per il PE è 575 nm e viene rilevato nel FL-2 canali. Nota: L'uso un BD FACS Calibur o BD FACS macchine Vantage, con il programma Cell Quest per la raccolta dei dati, si usa Forward Scatter Scatter vista laterale e nella scala di log per identificare le popolazioni di cellule, con dispersione laterale impostato su 250. FL1 ed FL2 sono entrambi in scala logaritmica e impostato su 550. Questi parametri forniscono un luogo iniziale di partenza per visualizzare fegato non-parenchimali cellule, e sono adeguati, se necessario sulla base di colorazione intensità delle popolazioni positivi e negativi. Isolare la popolazione di cellule CD133 + usando CD133 + cancello e raccogliere le cellule in cellule sterili mezzi di comunicazione filtrata. 5. Metodi di coltura cellulare FACS Centrifugare le cellule raccolte a 200 xg per 5 minuti. Risospendere il pellet cellulare in mezzi di cellule ovali con circa 5000 cellule per ml. Può iniziare con concentrazioni più elevate, fino a 50.000 cellule / ml per i primi esperimenti, e di ridurre quanto migliora la tecnica e la vitalità cellulare e migliora la resa complessiva. Cellule piastra su BD Biocoat Laminina rivestito Piastre a 96 pozzetti con 1000 cellule / cm 2. Posto in incubatore umidificato coltura cellulare a 37 ° C, con 5% di CO 2. Dopo 24 ore, aggiungere fattore di crescita degli epatociti (50 ng / nl), Epidermal Growth Factor (20 ng / ml). Per le singole cellule, isolare le cellule direttamente in 50 ml di mezzi di cellule ovali in ciascun pozzetto di una piastra ben 96 Laminina rivestito. FACS uso singola cella di impostazioni per la selezione rigorosa di una cellula positivo solo. Dopo 24 ore, aggiungere 50 ml di mezzi di cellule ovali con HGF e EGF come sopra al punto 5.2. Cambia completamente i media dopo 5-7 giorni. Una volta che le colonie sono in espansione superiore al 50% confluenti, che si verifica in genere dopo 2 settimane, a seconda del numero totale delle cellule vitalità placcato e cellule, le cellule possono essere suddivisi come segue 01:03. Celle divise con tripsina-EDTA 0,05%. Applicare appena sufficiente a coprire bene in basso, 50-100 microlitri / bene su 96 pozzetti. Posto in incubatore a 37 ° C per 3-5 minuti. Aggiungere 100 l di media per ciascun bene e trasferire tutti i liquidi a 5 ml di tubo. Aggiungere 1 ml di mezzi di comunicazione ad ogni provetta e centrifugare a 200 xg per 5 minuti. Risospendere le cellule in lamiera media nel piatto rivestito laminina, usando cellule da 1 bene alla piastra in 3 nuovi pozzi (1:3 ratio). 6. La conferma della bi-potenziale stato tramite RT-PCR Questa procedura è descritta nel manuale RNeasy protocollo, che viene fornito con il kit RNeasy. Usa RNeasy colonne micro per 96 colonie pozzetti. Aspirare il terreno di coltura di ogni bene. Aggiungere 75 microlitri RLT Buffer (dal kit RNeasy) direttamente a ciascun pozzetto. Raschiare fondo piatto con poliziotto gomma sterile. Pipettelysate in micro-tubo di centrifuga e la miscela vortex per 1 minuto. Aggiungi etanolo al 70% di lisati e mescolare pipettando. Trasferire la soluzione alla colonna RNeasy posto in una provetta 2 ml di raccolta (come fornito nel kit RNeasy) e centrifugare in micro-centrifuga per 15 secondi a 10.000 giri. Gettare eluiti filtrato. Riutilizzare il tubo di raccolta. Aggiungere 350 microlitri Buffer RW1 (RNeasy Kit) RNeasy alla colonna e centrifugare per 15 secondi a 10.000 giri per lavare la colonnamembrana. Gettare lavare eluiti. Aggiungere 10 L DNasi soluzione madre ho a 70 Buffer RDD microlitri (entrambi forniti nel kit RNeasy). Aggiungere il 80 microlitri DNasi I Buffer mix di incubazione RDD alla membrana colonna RNeasy e incubare per 15 minuti a temperatura ambiente. Aggiungere 350 microlitri Buffer RW1 (RNeasy kit) RNeasy alla colonna e centrifugare per 15 secondi a 10.000 giri per lavare la membrana. Gettare lavare eluiti e tubo di raccolta. Posizionare la colonna RNeasy in un nuovo 2 ml di tubo di raccolta (in dotazione nel kit RNeasy). Aggiungere 500 microlitri Buffer RPE (RNeasy Kit) RNeasy alla colonna e centrifugare per 15 secondi a 10.000 giri per lavare la membrana. Gettare lavare eluiti. Preparare l'80% di etanolo con RNase-free acqua (RNeasy Kit). Aggiungere 500 ml di etanolo all'80% alla centrifuga columnand RNeasy per 2 minuti a 10.000 giri. Gettare lavare eluiti. Posizionare la colonna RNeasy in un nuovo tubo di raccolta 2 ml (RNeasy Kit) e centrifugare a massima velocità per 5 minuti. Scartare qualsiasi lavare eluiti e tubo di raccolta. Posizionare la colonna RNeasy in un nuovo tubo di raccolta 1,5 ml (kit RNeasy). Aggiungere 14 microlitri di acqua RNasi-free (RNeasy Kit) per il centro della membrana colonna e centrifugare per 1 minuto alla massima velocità. Raccogliere filtrato con l'RNA purificato e trasferimento di ghiaccio se la creazione di cDNA subito o conservare a meno 80 ° C per un uso futuro. Trascrizione inversa usando Omniscript.Dilute inibitore della RNAsi ad una concentrazione finale di 10 unità / mL nelle gelide 1x tampone RT. Vortex per 5 secondi, e centrifugare a impulsi per 5 secondi. Preparare una miscela fresca master sul ghiaccio seconda pagina 13 di Omniscript protocollo. Vortex per 5 secondi, e centrifugare a impulsi per 5 secondi. Consigliamo di preparare un volume di Mastermix 10% superiore a quello richiesto per il totale richiesto per tutte le reazioni. Aggiungi RNA modello per singoli tubi contenenti master mix. Vortex per 5 secondi, e centrifugare a impulsi per 5 secondi. Incubare per 60 min a 37 ° C. Amplificazione di geni specifici epatociti (albumina) e cholangiocyte utilizzando DNA polimerasi HotStarTaq. Preparare miscela di reazione per pagina 15 del libro di HotStarTaq protocollo. Consiglia di diluire primer stock di concentrazione di 20 pm / mL, e con 1 ml / reazione tubo utilizzato per primer avanti e indietro. A seconda del numero di cellule inizialmente utilizzato per l'estrazione di RNA, si consiglia di dividere cDNA finale tra i 3 tubi di reazione (β-actina per il controllo del carico, Albumina, e KRT19) per iniziare. Disegno primer è elencati nella Tabella 1. Luogo provette di reazione nel termociclatore. Consiglia seguente programma di sperimentazione iniziale: 95 ° Cfor 15 minuti x 1 ciclo seguito dal 95 ° C per 30 secondi, 55 ° C per 30 secondi, 72 ° C per 30 secondi x 35 cicli, seguiti da 72 ° C per 10 minuti. I prodotti di PCR vengono analizzati l'uso del bromuro di etidio impregnata di gel. 7. Conferma di eventuali tumori della CD133 + cellule staminali Questa procedura può essere fatto con appena cellule isolate dal punto 4 o utilizzando cellule che sono stati colti dal punto 5. Si consiglia di effettuare i primi esperimenti con cellule in coltura, le cellule appena isolate avranno ridotto la vitalità e rendimento ridotto. Trypsinize cellule utilizzando tripsina-EDTA 0,05% a partire dal punto 5.5. Dopo 3-5 minuti di incubazione a 37 ° C, aggiungere 100 ml di media per ciascun bene e trasferire tutto il liquido da ciascun pozzetto a individuo provette da 5 ml (1 e = 1 tubo). Aggiungere 1 ml di mezzi di comunicazione ad ogni provetta e centrifugare a 200 xg per 5 minuti. Risospendere le cellule in 1 ml di PBS freddo ghiaccio. Rimuovere 10 ml di sospensione cellulare PBS e aggiungere 10 microlitri trypan blu. Utilizzando trypan esclusione blu, determinare il numero di cellule vive. Se si utilizza FACS cellule isolate, numero di cellulare sarà determinato dal numero di isolamento FACS. Cellule Centrifugare a 200 xg per 5 minuti e risospese in PBS a una concentrazione di 1 x 10 6 vivere cells/100 microlitri. Aggiungere 100 microlitri Matrigel. Sei settimane di età topi nudi immunodeficienti sono state iniettate per via sottocutanea con 28 ago gague. Iniettare 1 x 10 6 cellule in 200 microlitri per sito. I topi sono monitorati quotidianamente per la crescita del tumore. Una volta che i tumori forma, di solito dopo 3-4 settimane di incubazione, il volume del tumore viene misurata mediante pinze (altezza x larghezza x lunghezza). 8. Rappresentante dei risultati: Dal normale, fegato sano murino, il rendimento atteso cellulare delle cellule CD133 + staminali del fegato è di 1.000 a 5.000 al fegato. Queste cellule sono relativamente rari nel fegato quiescenti e non si espande bene nella cultura. Si consiglia di non utilizzare l'analisi sulle singole cellule del fegato normale e la resa di cellule vitali che si espanderà è estremamente bassa. Per i fegatini con significative lesioni croniche, come la dieta DDC 0,1% per 6 settimane 1 o modificazione genetica che provoca lesioni croniche, come il MAT1a – / – o PTEN specifici fegato – / – topi, 2-4 il numero previsto di celaumenta ls isolati, con fino a 100.000 cellule isolate / fegato (Figura 2). Se si utilizza modelli genetici, la conoscenza del tasso di sviluppo spontaneo di tumori è fondamentale, in quanto queste procedure per l'isolamento delle cellule staminali del fegato dovrebbero essere condotti in tumori animali in libertà. Per esempio, se il MAT1a – / – modelli di attestati tumori spontanei a 18 mesi, si consiglia di utilizzare gli animali non oltre 15-16 mesi, prima di qualsiasi tumori segnalati spontanea. Isolamento di singole cellule dai modelli lesione cronica produrrà diversi (3-9 colonies/96 pozzetti) colonie che si espandono da singole cellule una volta che la procedura è padroneggiata, e la vitalità cellulare è assicurata. Figura 3 attuale rappresentante immagini a contrasto di fase di colonie derivate da singole cellule CD133 + espanse dopo 7 giorni. La conferma della bi-potenziale è stato condotto utilizzando albumina e Krt19 RT-PCR. Colonie da singole cellule espanse dimostrerà sia espressione di marcatori di epatociti (albumina) e colangiociti (Krt19). Figura 4 mostra bi-potenziale espressione da tre colonie isolate, con circa 25 cellule / colonia a 7 giorni. CD133 + cellule staminali dal fegato normale e danno epatico indotto chimicamente (es. dieta DDC 0,1% per 6 settimane) non formare tumori in topi nudi. CD133 + cellule staminali da specifici modelli genetici (MAT1a – / – o PTEN specifici fegato – / – topi) si formano i tumori in topi nudi se isolato in ritardo alla fine del pre-tumorali fase lesione cronica. Questo fenotipo tumorale formazione è attualmente identificata come una cellula staminale del cancro 2-4 Ad esempio, il MAT1a -. / – Tumori al fegato nei topi forma spontanea a 18 settimane di età. CD133 + cellule staminali epatiche isolate a 15-16 settimane, durante una fase tardiva lesione cronica di malattia del fegato, sarà formare tumori in topi nudi. Figura 5 mostra i tumori rappresentante di iniezione bilaterale di 1 x 10 6 cellule espanse in vitro dalle singole cellule CD133 + staminali del fegato. Gene Primer avanti Primer reverse β-Actina 5'-TGTTACCAACTGGGACGACA-3 ' 5'-GGGGTGTTGAAGGTCTCAAA-3 ' Albumina 5'-CATGCCAAATTAGTGCAGGA-3 ' 5'-GCTGGGGTTGTCATCTTTGT-3 ' Cheratina 19 5'-TGCTGGATGAGCTGACTCTG-3 ' 5'-AATCCACCTCCACACTGACC-3 ' Tabella 1: progettazione Primer per RT-PCR Figura 1: Schema generale di metodi. Figura 2: CD133 + cellule staminali del fegato identificati altamente arricchito CD45 impoverito non frazione parenchimale epatica di controllo indenne da topi wild-type dimostra 0,4% cellule CD133 + nel altamente arricchito CD45 impoverito non parenchimali frazione.. Nella genetica knock-out MAT1a – / -, che è un modello di danno epatico cronico, la popolazione si espande CD133 10 volte o più nella frazione stessa altamente arricchito. Figura 3: L'espansione di colonie singole CD133 + cloni a contrasto di fase le immagini di quattro colonie derivate da singole cellule CD133 + ampliato laminina rivestito Piastre a 96 pozzetti.. Figura 4:. Bi-potenziale di espressione genica di cellule staminali del fegato CD133 + colonie clonale ampliato Al 7 ° giorno, le colonie sono circa 25 cellule. L'espressione genica dimostra espressione di marker marcatore epatociti albumina e cholangiocyte Krt19, confermando bi-potenziale stato di cellule CD133 +. Figura 5: CD133 + cellule staminali del fegato formare tumori in topi nudi Le frecce indicano i tumori in crescita 4 settimane dopo la 1×10 6 cellule CD133 + iniettato da MAT1a – / – modello.. Cellule CD133 + da un infortunio tossina indotta croniche del fegato, come CCl 4 o 0,1% la dieta DDC, non si formano tumori. La formazione di tumori viene utilizzato per identificare potenziale maligno, o staminali fenotipo di cellule di cancro tra la popolazione di cellule staminali.