Isolatie van CD133 + lever stamcellen voor klonale expansie

Alle oplossingen, media, instrumenten, filters en buizen moeten steriel en behandeld met steriele techniek om het risico op verontreiniging. Bereid alle buffers en media 24 uur van tevoren en bewaar bij 4 ° C. 1. Parenchymale en niet-parenchymale scheiding van hele lever Bereid de enzymoplossing voor digestie met een 15 cc buis met schroefdop in 10 ml steriel PBS bevattende 5 mg collagenase, 5 mg pronase en 1 mg DNAse. Euthanaseren muis met behulp van instelling goedgekeurde (Institutionele Animal Care en gebruik Comite) methode zoals CO 2 stikken. Veeg buikstreek van euthanasie dieren met 70% ethanol-oplossing. Met behulp van steriele instrumenten, open buikholte en explantatie lever en-blok. Verwijder galblaas van geëxplanteerd lever. Overdracht hele lever om laminaire stroming kap in gesloten steriele schotel. Deze procedure wordt voltooid in een laminaire stroming kap. Met behulp van een steriele scheermesje, gehakt lever metcombinatie van meerdere horizontale en verticale delen 1 minuut in steriele schotel. Plaats ¼ van gehakt lever pulp in 15 cc tube met 10 cc PBS met collagenase, pronase, en DNAse vanaf stap 1.1 hiervoor. Herhaal dit met elke ¼ gehakt lever. Place buizen met ¼ gehakt lever pulp en enzymen in een waterbad bij 37 ° C gedurende 45 minuten, met shaker bij 1-2 cycli / seconde. Veeg buizen met 70% ethanol na verwijdering van waterbad vóór de overdracht naar laminaire stroming kap. Deze procedure wordt voltooid in een laminaire stroming kap. Zeef verteerd lever pulp door 70 micron gaasfilter te verzamelen in een steriele schaal. Met 2 ml steriele DMEM: F12 medium met 10% hitte geïnactiveerd foetaal runderserum, spoel het filter en de rubber uiteinde van een zuigerstang mash de pulp verteerd door het filter. Herhaal 5 keer de totale hoeveelheid filtraat ongeveer 20 ml. Verdeel het filtraat in 2 gelijke 15 ml buizen. Alle transfers moet worden ingevuld in laMinar zuurkast, en het gebruik van gekoelde centrifuge bij 4 ° C indien beschikbaar. Centrifugeer bij 50 xg gedurende 1 minuut. Sla supernatant # 1 en gooi parenchymale pellet. Centrifugeer supernatant # 1 bij 50 xg gedurende 1 minuut. Sla supernatant # 2 en gooi pellet. Centrifugeer supernatant # 2 bij 50 xg gedurende 1 minuut. Sla supernatant # 3 en gooi pellet. Centrifugeer laatste supernatant # 3 voor 180 xg gedurende 8 minuten tot niet-parenchymale fractie te verkrijgen. 2. Erytrocyten lysis Werken in laminaire stroming kap, houden cellen koud en gebruiksklare oplossingen afgekoeld tot 4 ° C. De nacht voordat de procedure, voor te bereiden rode cel lysis buffer door verdunning van 10X concentratie voorraad BD Pharm buffer Lyse met een 1:10 verdunning met steriel gedestilleerd water. 1X solutionshould worden 30 dagen bewaard bij 4 ° C. De nacht voor de procedure voor te bereiden Miltenyi buffer met steriele PBS, 0,5% runderserumalbumine, en 2 mM EDTA. Filter oplossing met vacuümfilterunit met 0,45 micron filter. Cover top van tilter apparaat met originele plastic deksel en zet hem vast met plastic omslag. Storeentire filtereenheid bij 4 ° C gedurende 12 uur te ontgassen EDTA. Filtereenheid kan worden vervangen door standaard steriele dop na 12 uur. Deze procedure wordt voltooid in een laminaire stroming kap. Een 5 ml steriele buis, resuspendeer niet-parenchymale pellet uit stap 1.6 hierboven in 1 ml 1X verdund rode bloedcellen lysis buffer van 2.1. Doe het buisje voor de overdracht van de laminaire stroming kap. Voorzichtig vortexen voor 5 seconden en incubeer gedurende 15 minuten bij 4 ° C beschermd tegen licht. Centrifugeer bij 200 xg gedurende 5 minuten. Deze procedure wordt voltooid in een laminaire stroming kap. Gooi gelyseerde RBC's in supernatant en resuspendeer pellet in 1 ml ijskoud en steriel Miltenyi buffer. Centrifugeer bij 200 xg gedurende 5 minuten. Deze procedure wordt voltooid in een laminaire stroming kap. Gooi supernatant en resuspendeer pellet in 1 ml ijskoud en sterielMiltenyi buffer. Verwijder 10 ul van PBS celsuspensie en voeg 10 ul tryan blauw. Tellen remainingnon-parenchymale cellen met hemocytometer. 3. CD45 hematopoietische celdepletie van niet-parenchymale fractie Werken in laminaire stroming kap, houden cellen koud en gebruiksklare oplossingen afgekoeld tot 4 ° C. Suspendeer cellen in 100 ul buffer Miltenyi per 107 cellen tot 108 totale cellen. 20 pi toepassing Miltenyi CD45 antilichaam microbead per 107 cellen en incuberen bij 4 ° C gedurende 15 minuten. Voeg extra 2 ml Miltenyi buffer en centrifugeer bij 200 xg gedurende 5 minuten. Verwijder supernatant. Resuspendeer celpellet (tot 108 totaal cellen) in 1 ml buffer Miltenyi. In laminaire stroming kap, filter cellen met behulp van Miltenyi LD magnetische kolom. Begin met het plaatsen kolom in magnetische houder (Miltenyi MidiMACS of QuadroMACS). Hieronder Plaats steriele 5 ml tube filter filtraat op te vangen. Bereid kolom door het laden van 2 ml MilteNJI buffer. Zodra voorfilter wassen is voltooid, laadt cellen op LD kolom. Zodra de celsuspensie is in de kolom, voeg 1 ml Miltenyi buffer en herhaal 1 ml Miltenyi buffer te wassen 2 extra keer. Gebruik GEEN plunjer voorzien van kolom om de snelheid van filtratie te verhogen. ALLEEN verzamelen filtraat wanneer de filter in geplaatst in de magnetische houder. Centrifugeer het filtraat verzameld van ongeveer 5 ml (kolom heeft de resterende 1 ml) van CD45-verarmde niet-parenchymale cellen bij 200 xg gedurende 5 minuten. Gooi de kolom met de bewaarde CD45 positieve cellen. 4. Flowcytometrie isolatie van CD133 positieve cellen Bereid ovale cel media. Gebruik 01:01 DMEM: F12 medium met 10% hitte geïnactiveerd foetaal kalfserum als base, en voeg insuline (1 pg / ml), HEPES (5 mol / L) en penicilline / streptomycine (1% volume / volume). Filter oplossing met vacuüm filter van 0,45 micron filter. Resuspendeer cellen in Miltenyi buffer bij 100 μL per 10 7 cellen. Voeg 2 pl CD133-PE geconjugeerd antilichaam. Gebruikmaking van een tweede groep cellen geïncubeerd met IgG-PE geconjugeerd antilichaam als een controle. Bewaar een derde groep cellen zonder kleuring als ongekleurde controle voor FACS. Incubeer bij 4 ° C gedurende 15 minuten in het donker. Resuspendeer in 2 ml vlekken buffer. Centrifugeer bij 200 xg gedurende 5 minuten. Gooi supernatant en resuspendeer pellet in 1 ml Miltenyi buffer. Deze stap wordt uitgevoerd onder normale flowcytometrie celsortering procedures, die instellingsspecifieke zijn. Met behulp van ongekleurde cellen en IgG PE gekleurde cellen, aan te passen sorteren parameters voor optimale gating van CD133 + celpopulatie. PE (R-Phytoerythrin) kunnen in het algemeen worden gebruikt met een flowcytometer die een laser die uitzendt bij 488 nm. De piekemissie van PE is 575 nm en wordt gedetecteerd in de FL-2 kanaal. Opmerking: Het gebruik van een BD FACS Calibur of BD FACS Vantage machines, met het Cell Quest-programma voor het verzamelen van gegevens, gebruiken we vooruit Scatter en Side Scatter weergave in de log schaal celpopulaties identificeren met zijwaartse verstrooiing ingesteld op 250. FL1 en FL2 zijn zowel in log-schaal en is ingesteld op 550. Deze parameters een eerste startpunt aan de lever niet-parenchymale cellen weergeven, en worden aangepast indien nodig op basis kleurintensiteit van positieve en negatieve populaties. Isoleer de CD133 + celpopulatie met behulp van CD133 + poort en het verzamelen van de cellen in steriel gefiltreerd cel media. 5. Celcultuurmethoden Centrifuge FACS verzamelde cellen bij 200 xg gedurende 5 minuten. Resuspendeer celpellet in ovaal celmedium met ongeveer 5000 cellen per ml. Kan beginnen met hogere concentraties tot 50.000 cellen / ml voor de eerste experimenten en verminderen techniek verbetert en de totale opbrengst en levensvatbaarheid van de cellen verbetert. Cellaag op BD Biocoat laminine 96 putjes bekleed met 1000 cellen / cm 2. In bevochtigde incubator celkweek bij 37 ° C met 5% CO2. Na 24 h toe hepatocytgroeifactor (50 ng / nl) en epidermale groeifactor (20 ng / ml). Voor enkele cellen direct isoleren cellen in 50 ui ovaal celmedia in elke well van een 96 well laminine beklede plaat. Gebruik enkele cel FACS instellingen voor strenge selectie van een positieve cel alleen. Na 24 uur, voeg 50 ul ovaal celmedium met HGF en EGF zoals hierboven in stap 5.2. Wijzig media volledig na 5-7 dagen. Zodra de groeiende kolonies groter zijn dan 50% confluent is meestal het geval na 2 weken, afhankelijk van het totale aantal cellen geplateerd en cellevensvatbaarheid, kunnen de cellen worden gesplitst 01:03 als volgt. Split cellen met trypsine-EDTA 0,05%. Breng net genoeg om te dekken en onderkant, 50-100 ul / goed op plaat met 96 putjes. In plaats incubator bij 37 ° C gedurende 3-5 minuten. Voeg 100 ul van media aan elk putje en de overdracht van alle vloeistof 5 ml buis. Voeg 1 mL media aan elke buis en centrifugeer bij 200 xg gedurende 5 minuten. Resuspendeer cellen in media plaat in laminine gecoate schaal, met behulp van cellen van 1 goed op plaat in 3 nieuwe putten (1:3 verhouding). 6. Bevestiging van bi-potentieel status met behulp van RT-PCR Deze procedure wordt beschreven in het handboek RNeasy protocol dat wordt geleverd met de RNeasy Kit. Gebruik RNeasy micro kolommen voor plaat met 96 putjes kolonies. Zuig kweekmedium uit elk putje. Voeg 75 pl buffer RLT (van RNeasy Kit) direct aan elk putje. Schraap plaat bodem met steriele rubberen politieman. Pipettelysate in micro-centrifugebuis en vortex mengsel gedurende 1 minuut. Voeg 70% ethanol om lysaten en meng door pipetteren. Breng de oplossing RNeasy kolom in een 2 ml verzamelbuis (als vermeld in RNeasy Kit) en gecentrifugeerd in micro-centrifuge gedurende 15 seconden bij 10.000 rpm. Gooi geëlueerd filtraat. Hergebruik de verzamelbuis. Voeg 350 ul Buffer RW1 (RNeasy Kit) de RNeasy kolom en centrifugeer gedurende 15 seconden bij 10.000 rpm om de kolom te wassenmembraan. Gooi geëlueerd wassen. Voeg 10 ul DNase I stockoplossing aan 70 pl Buffer RDD (beide geleverd in RNeasy Kit). Voeg 80 ul DNase I Buffer RDD incubatie mix de RNeasy kolom membraan en incubeer gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur. Voeg 350 ul Buffer RW1 (RNeasy kit) de RNeasy kolom en centrifugeer gedurende 15 seconden bij 10.000 rpm aan het membraan te wassen. Gooi geëlueerd wassen en verzamelbuis. Plaats de RNeasy kolom in een nieuwe 2 ml collectie buis (geleverd in RNeasy kit). Voeg 500 ul Buffer RPE (RNeasy Kit) de RNeasy kolom en centrifugeer gedurende 15 seconden bij 10.000 rpm aan het membraan te wassen. Gooi geëlueerd wassen. Bereid 80% ethanol met behulp van RNase-vrij water (RNeasy Kit). Voeg 500 ui 80% ethanol om de RNeasy columnand centrifuge gedurende 2 minuten bij 10.000 rpm. Gooi geëlueerd wassen. Plaats de kolom in een RNeasy nieuwe 2 ml verzamelbuis (RNeasy Kit) en centrifugeer op volle snelheid gedurende 5 minuten. Gooi alle geëlueerd wassen en colmeling buis. Plaats de kolom in een RNeasy nieuwe 1,5 ml verzamelbuis (RNeasy kit). Voeg 14 ul RNase-vrij water (RNeasy Kit) naar het midden van de kolom membraan en centrifugeer gedurende 1 minuut bij volle snelheid. Verzamel het filtraat met gezuiverd RNA en transfer naar ijs als maken cDNA onmiddellijk of bewaar bij -80 ° C voor toekomstig gebruik. Reverse transcriptie die Omniscript.Dilute RNase inhibitor tot een eindconcentratie van 10 eenheden / ul in ijskoude 1x Buffer RT. Vortex gedurende 5 seconden, en hartslag centrifuge gedurende 5 seconden. Bereid een nieuwe master mix op ijs volgens pagina 13 van Omniscript protocol. Vortex gedurende 5 seconden, en hartslag centrifuge gedurende 5 seconden. Aanbevolen tot een volume van mastermix 10% groter dan voor de totale vereiste voor alle reacties te bereiden. Toevoegen template RNA de individuele buizen met master mix. Vortex gedurende 5 seconden, en hartslag centrifuge gedurende 5 seconden. Incubeer gedurende 60 min bij 37 ° C. PCR amplificatie van hepatocyten(Albumine) en cholangiocyte specifieke genen gebruik HotStarTaq DNA polymerase. Bereid reactiemengsel per pagina 15 van HotStarTaq protocol boek. Aanbevolen verdunning stock primers concentratie van 20 pm / pl en met 1 ul / reactiebuis gebruikt voor forward en reverse primers. Afhankelijk van het aantal cellen aanvankelijk gebruikt voor RNA-extractie, raden verdelen laatste cDNA uit 3 reactiebuizen (β-actine voor ladingcontrole, albumine en KRT19) om te beginnen. PCR primer design is vermeld in tabel 1. Plaats reageerbuisjes in thermocycler. Aanbevolen volgende programma initiële experimenten: 95 ° CVoor x 15 minuten 1 cyclus gevolgd door 95 ° C gedurende 30 seconden, 55 ° C gedurende 30 seconden, 72 ° C gedurende 30 seconden x 35 cycli, gevolgd door 72 ° C gedurende 10 minuten. PCR-producten worden geanalyseerd met ethidiumbromide geïmpregneerde agarose gel. 7. Bevestiging van tumor potentieel van CD133 + stamcellen Deze procedure kanworden uitgevoerd met vers geïsoleerde cellen van 4 of van cellen die zijn gekweekt van stap 5. Wij raden het uitvoeren van de eerste experimenten met gekweekte cellen, zal zo vers geïsoleerde cellen hebben verminderd levensvatbaarheid en verminderde opbrengst. Trypsinize cellen met trypsine-EDTA 0,05% van stap 5.5 hierboven. Na 3-5 minuten incubatie bij 37 ° C, voeg 100 ul van de media aan elk putje en de overdracht van alle vloeistof uit elk putje om individuele 5 ml buizen (1 well = 1 tube). Voeg 1 ml media aan elke buis en centrifugeer bij 200 xg gedurende 5 minuten. Resuspendeer cellen in 1 ml ijskoude PBS. Verwijder 10 ul van PBS celsuspensie en voeg 10 ul trypan blauw. Met trypan blauw exclusie, vast aantal levende cellen. Bij gebruik van FACS geïsoleerde cellen, wordt het aantal cellen bepaald door FACS isolatie tellen. Centrifugeer cellen bij 200 xg gedurende 5 minuten en opnieuw gesuspendeerd in PBS bij een concentratie van 1 x 10 6 levende cellen/100 pl. Voeg 100 ul Matrigel. Zes weken oude immuun-deficiënte Nude muizen werden subcutaan geïnjecteerd met behulp van 28 gague naald. Injecteer 1 x 10 6 cellen in 200 pi per plaats. Muizen worden gecontroleerd tumorgroei dag. Eenmaal tumoren vormen, meestal na 3-4 weken incubatie wordt tumorvolume gemeten met behulp van remklauwen (hoogte x lengte x breedte). 8. Representatieve resultaten: Van normale, gezonde muizen lever, de verwachte opbrengst van cellulaire CD133 + lever stamcellen is 1.000 tot 5.000 per lever. Deze cellen zijn relatief zeldzaam in rustige lever en zal niet goed groeien in cultuur. Wij raden u niet aan single cell analyse van normale lever en de opbrengst van levensvatbare cellen die zal uitbreiden is extreem laag. Van levers met significante chronische schade, zoals DDC 0,1% dieet gedurende 6 weken 1 of genetische modificatie resulteert in chronische letsels, zoals MAT1a – / – of lever specifieke PTEN – / – muizen, 2-4 het verwachte aantal cells geïsoleerd stijgt, tot 100.000 cellen geïsoleerd / lever (figuur 2). Bij gebruik van genetische modellen, kennis van spontane tumoren tarief is van cruciaal belang, omdat deze procedures voor de lever stamcellen geïsoleerd moeten worden uitgevoerd in tumorvrij dieren. Bijvoorbeeld, als de MAT1a – / – modelformulieren spontane tumoren op 18 maanden, adviseren wij het ​​gebruik van dieren uiterlijk 15 tot 16 maanden, voorafgaand aan de gemelde spontane tumoren. Isolatie van enkele cellen van chronische blessure modellen levert een aantal (3-9 colonies/96 wells-plaat) kolonies die uit te breiden van een enkele cellen eenmaal de procedure wordt beheerst, en levensvatbaarheid van de cellen wordt gewaarborgd. Figuur 3 aanwezig vertegenwoordiger fasecontrast beelden van kolonies afkomstig van enkele CD133 + cellen uitgebreid na 7 dagen. Bevestiging van bi-potentiële status wordt uitgevoerd met albumine en Krt19 RT-PCR. Kolonies van geëxpandeerde enkelvoudige cellen demonstreert zowel expressie van markers van hepatocyten (Albumin) en cholangiocyten (Krt19). Figuur 4 toont bi-potentieel expressie van drie geïsoleerde kolonies, met ongeveer 25 cellen / kolonie na 7 dagen. CD133 + stamcellen uit normale lever en chemisch geïnduceerde leverbeschadiging (bijv. DDC 0,1% dieet gedurende 6 weken) niet tumoren te vormen in naakt muizen. CD133 + stamcellen van specifieke genetische modellen (MAT1a – / – of lever specifieke PTEN – / – muizen) zal vormen tumoren in naakt muizen als die laat late pre-tumor chronisch letsel fase. Deze tumor vormen fenotype wordt momenteel beschouwd als een kankerstamcel 2-4 voor bijvoorbeeld de MAT1a -. / – Muizen vormen spontane levertumoren op 18 weken. CD133 + lever stamcellen in 15-16 weken tijdens een late fase van chronisch letsel leverziekte, vormt tumoren in naakt muizen. Figuur 5 toont representatieve tumoren bilaterale injectie van 1 x 10 6 cellen geëxpandeerd in vitro uit een CD133 + leverstamceltechnologies. Gen Forward Primer Reverse Primer β-actine 5'-TGTTACCAACTGGGACGACA-3 ' 5'-GGGGTGTTGAAGGTCTCAAA-3 ' Albumine 5'-CATGCCAAATTAGTGCAGGA-3 ' 5'-GCTGGGGTTGTCATCTTTGT-3 ' Keratine 19 5'-TGCTGGATGAGCTGACTCTG-3 ' 5'-AATCCACCTCCACACTGACC-3 ' Tabel 1: Primer ontwerp voor RT-PCR Figuur 1: Algemeen schema methoden. Figuur 2: CD133 + lever stamcellen die in sterk verrijkte CD45 verarmd niet-parenchymale fractie Controle onbeschadigde lever van wild-type. muizen toont aan 0,4% CD133 + cellen binnen de hoogverrijkt CD45 verarmd niet-parenchymale fractie. In de genetische knock-out MAT1a – / -, een model van chronische leverbeschadiging, de CD133 bevolking omhoog 10 maal of meer in dezelfde hoog verrijkte fractie. Figuur 3: Uitbreiding van kolonies van enkele CD133 + klonen Fase-contrast beelden van vier kolonies afkomstig van enkele CD133 + cellen uitgebreid op laminine beklede platen met 96 putjes.. Figuur 4: Bi-potentieel genexpressie van CD133 + leverstamceltechnologie klonaal uitgebreid kolonies op dag 7, kolonies zijn ongeveer 25 cellen.. Genexpressie toont uitdrukking van hepatocyt marker albumine en cholangiocyte marker Krt19, bevestigt bi-potentiële status van CD133 + cellen. ve_content "> Figuur 5: CD133 + lever stamcellen vormen tumoren in naakt muizen Pijlen geven tumoren groeien 4 weken na 1×10 6 CD133 + cellen geïnjecteerd MAT1a – / – model.. CD133 + cellen van toxine geïnduceerde chronische leverbeschadiging zoals CCI4 of 0,1% DDC dieet, vormen geen tumoren. Tumorvorming gebruikt om maligne potentieel of kanker stamcel fenotype in de stamcelpopulatie identificeren.