Cut-loading: Uma ferramenta útil para examinar a extensão da Gap Coupling Tracer junção entre neurônios da retina

1. Intacta retina neural preparações para goldfish, camundongos e coelhos Realizar todas as etapas a seguir, incluindo aqueles descritos em "2) Corte-loading", sob constante iluminação ambiente (background). Por favor, note que, para efeitos deste protocolo, os procedimentos são descritos como a realizada na escuridão constante (isto é, com muito escuro (ou seja, "escotópica") condições ≤ 0,0001 lux) usando óculos de visão noturna infravermelha, mas outros níveis de maior intensidade de iluminação ambiente constante pode ser usado em vez de determinar o efeito de outros níveis de iluminação ambiente em gap de acoplamento junção marcador. Dark-se adaptar o animal experimental (mouse goldfish, ou coelho) por pelo menos 1 hora antes da cirurgia. Conforme descrito anteriormente 7, profundamente anestesiar peixinho colocando-os em tricaina metanosulfanato (MS222, 150 mg / L de água tamponada (bicarbonato de sódio contendo) do tanque de peixes), e profundamente anestesiar ratos com cetamina (100 mg/ Kg, ip) e Rompun (10 mg / kg, ip). Profundamente anestesiar coelhos com uretana (dose de ataque: 2,0 g / kg, ip) e também usar anestesia intraorbital local (2% xilocaína), como descrito anteriormente 8. Todos os procedimentos experimentais envolvendo o cuidado e uso de animais deve ser realizada de acordo com as diretrizes federais e ser revisado e aprovado pelo cuidado animal local da universidade e comitês uso. (Nota:. Nos experimentos aqui descritos, todos os procedimentos experimentais envolvendo o cuidado e uso de peixes, camundongos e coelhos foram realizados de acordo com as diretrizes do NIH e foram revistos e aprovados pela Ohio State University Animal Care Institucional e Comitê de Uso) Para peixes, camundongos e coelhos, após enucleação, remova a parte anterior de cada globo ocular. Em seguida, coloque um pedaço de papel de filtro em cima da porção posterior do olho e inverter o papel de filtro e do olho, de modo que o papel de filtro fica embaixo da porção posterior do olho. Em seguida, usando bemforceps dissecar a retina neural intacta da parte posterior do olho suavemente descascar o epitélio pigmentar / coróide / esclera, que são ligados uns aos outros, a partir da retina neural, que é ligado ao papel de filtro. Como isso é feito, cortou o nervo óptico usando multa de mola tesoura. A retina neural, até fotorreceptoras lado-oriented, agora deve ser anexado ao papel de filtro e separado do resto do olho. 2. Cut-loading Submergir o retinas em solução Ringer oxigenados (Tabela 1) em uma placa de 6 poços (~ 5 mL / poço) por 30 min sob constante ambiente (background) iluminação (por exemplo, sob muito escuro (ou seja, "escotópica") condições) com ou sem uma droga teste. Manter retinas de peixes em oxigenada (5% CO 2 / 95% O 2) de bicarbonato baseado em Ringer a 22 ° C por selar a placa de 6 poços com parafilme e manter retinas do rato e coelho em 36 ° C em 5% de CO 2 / 95% O <sub> 2 incubadora. Quando uma droga teste é usado, ele deve estar presente durante todas as etapas subseqüentes, até a fixação Prepare a solução marcador (tipicamente 100 mL) pela dissolução neurobiotin (0,5%), uma molécula de biotina, em solução de Ringer imediatamente antes do corte através da retina. Note-se que 0,5% rodamina dextran (alta (> 10.000) MW) pode ser adicionado à solução. Devido ao seu alto peso molecular, rodamina dextran não atravessa junções e as células apenas rótulos que foram danificadas pelo corte. Como mostrado na figura. 3, esta é uma maneira útil para distinguir as células que se acumularam neurobiotin por terem sido feridos, daqueles que acumularam o marcador por difusão através de junções. Coloque a solução neurobiotin em um vidro (ou plástico) placa de Petri, toque no papel filtro, para que a retina está ligado, em um papel toalha para remover excesso de Ringer, mergulhe uma lâmina de barbear (ou lâmina afiada outros) na solução e neurobiotin on fazer um corte radial através da retina e papel de filtro. Se preferir, espaçadores podem ser usadas para que o corte é feito através da retina, mas não o papel de filtro. O corte deve ser orientadas perpendicularmente à superfície da retina. Mergulhe a lâmina de barbear na solução neurobiotin novamente e cortar a retina uma segunda vez. Repita este até 4 cortes por retina (ver Fig. 1.). Use um microscópio de dissecação ao fazer cortes de navalha pelo mouse e outros pequenos retinas. Como mostrado na figura. 1 submergir, a retina de novo em meio Ringer frescas, com ou sem drogas teste, usando uma placa de 6 poços (5 mL de Ringer / poço). Incubar a retina de 15 min para permitir a carga e difusão. Lavar três vezes por 5 min cada um com média Ringer frescas, com ou sem drogas teste. Fixar a retina com paraformaldeído a 4% em 0,1 M fosfato tampão (PBS, pH 7,4) por 1 hora em temperatura ambiente. Lave com 0,1 M PBS overnight a 4 ° C. No dia seguinte, reagir wom 2% estreptavidina-Alexa 488 (concentração final 10 mg / mL) em 0,1 M PBS + 0,3% Triton X-100, e manter durante a noite a 4 ° C. Lavar três vezes por 10 min cada um com 0,1 M PBS a RT Em PBS, descolar a retina do papel de filtro e, em seguida, usando um pincel fino, coloque a retina, até fotorreceptoras lado-oriented, em um slide. Suavemente montar com Vectashield meio de montagem (Vector Laboratories, Burlingame, CA). Tirar fotos com um microscópio confocal de varredura a laser (por exemplo, Zeiss 510 META) na mesma ampliação, resolução e configurações para cada condição experimental, de modo que você pode comparar os efeitos de diferentes condições experimentais (teste de drogas, por exemplo, condições de iluminação) sobre a extensão da gap junção traçador de acoplamento (Fig. 2A-C e Figo. 4A-C). Embora uma única imagem pode conter todas as células marcadas, é recomendado que você coletar um z-stack da área de interesse e recolhê-la em um únicoda imagem. 3. Quantificação do traçador acoplamento com ImageJ No navegador de imagem LSM, abra a imagem, clique em Exportar e salvar a imagem como um pouco TIF-16 NÃO arquivo compactado. Barra de escala devem ser incluídos nesta imagem TIF. NIH utilizando software ImageJ, medir a intensidade de fluorescência de Alexa-488-rotulados neurobiotin de ampliação de imagens de baixa todo-mount retinas. Abra o arquivo TIF utilizando o software ImageJ e desenhe uma linha reta correspondente à barra de escala. Ir para ANALISAR, SET SCALE e digite a distância conhecida e unidade de comprimento, em seguida, clique em OK. Agora os resultados da medição podem ser apresentados em unidades calibradas, como milímetros. Selecione a área de interesse usando a ferramenta de seleção retangular. O pico de fluorescência deve ser posicionada na borda esquerda de sua seleção. Certifique-se que não há nenhum sinal de fluorescência perto da borda direita. Se não, rodar a imagem ativa (IMAGE, então ROTATE). CliqueAnalisar e PLOT PERFIL. Você deverá ver uma curva com um decaimento exponencial da esquerda para a direita. Clique em Copiar na janela pop-up e cole no EXCEL. Agora você vê duas colunas mostrando a distância do corte (coluna da esquerda) e da intensidade de fluorescência em função da distância a partir do corte (coluna da direita). Divida cada valor bruto de fluorescência pelo valor máximo de fluorescência para obter a intensidade relativa de fluorescência. Copiar duas colunas correspondentes à distância entre o corte (X) ea intensidade de fluorescência relativa (Y), e depois colá-los no software Origin. Fit com o decaimento exponencial função # 1 (Fig. 2D e Fig. 4D.), Que está na forma: Y = Y 0 + Y max * exp (-x / λ) onde Y é a intensidade relativa de fluorescência, o Y é a fluorescência de fundo, Y max é o máximo relativo de fluorescência, λ é o space (comprimento) constante, e x é a distância entre o corte. Compare o espaço constante (λ) valores em diferentes condições experimentais utilizando o t-test ou ANOVA (Fig. 2E e Figo. 4E). Note-se que técnicas alternativas de quantificação têm sido descritos por outros 13,14. 4. Resultados representante Exemplos representativos de células fotorreceptoras traçador de acoplamento, conforme determinado pelo corte de carga são apresentados nas Figuras 2 e 3 (peixes) e Figura 4 (coelho). Confocal imagens foram tiradas usando as mesmas configurações para comparação (Fig. 2A-C e Figo. 4A-C) ea intensidade de fluorescência foi plotado como uma função da distância a partir do corte e equipados pela função exponencial mostrada na No. 3,8 acima (Fig. 2D e Figo. 4D). Valores de espaço constante para cada condiçãosão mostrados nas Figuras 2E e 4E, ilustrando que a extensão do gap de acoplamento junção traçador pode ser quantificada usando a técnica de corte de carga. Além disso, os resultados são altamente reprodutível. Utilização da técnica de corte-carregamento como um meio de quantificar o grau de abertura de acoplamento junção traçador também é validado pela constatação de que a intensidade de fluorescência diminui exponencialmente como uma função da distância entre o corte em todos os casos examinados 7,8 (ver também Figs. 2D e 4D aqui), indicando que entrou no neurobiotin fotorreceptores através do corte de navalha, e não de outros sites da retina. Além disso, a diferença qualitativamente similares dia / noite em fotorreceptoras acoplamento marcador de células observadas em goldfish com injeções de traçador em cones simples e com corte de carga-7 substancia corte de carga, como um meio relativamente precisas de medir a extensão do acoplamento fotorreceptoras. O corte-lOLOCAR técnica também pode ser usado para investigar outros tipos de sinapses elétricas na retina. Por exemplo, a Figura 5 ilustra esse coelho tipo A (Fig. 5A) e tipo B (Fig. 5B) células horizontais exibem homóloga tracer acoplamento seguintes corte de carga ea difusão das neurobiotin sob condições de adaptação ao escuro. Composto Peixe Mouse Coelho NaCl 130 120 117 NaHCO 3 20 25 30 NaH 2 PO 4 – 1 0,5 KCL 2,5 5 3,1 Glicose 10 10 10 MgCl 2 1 – – MgSO 4-7H 2 O – 1 1,2 Glutamina – 0,1 0,1 CaCl 2 0,7 2 2 Tabela 1: Composição das soluções de Ringer para mouse goldfish e retinas de coelhos. As concentrações são apresentados em mM. Soluções de Ringer são aeradas com 5% de CO 2 / 95% O 2 e mantidos a 22 ° C (peixe) ou 36 ° C (mamíferos). "-": Não incluídos na campainha para esta espécie. Figura 1:. Fluxograma mostrando o procedimento de corte de carga. Após o isolamento of intacta retina neural, vários cortes radiais foram feitas por uma lâmina que foi mergulhado em solução neurobiotin 0,5%. A retina foi incubado por tracer carga e difusão, e depois lavadas antes de fixação com paraformaldeído a 4% (PFA) em 0,1 M tampão fosfato (PB). Tracer acoplamento foi examinada usando-estreptavidina conjugados Alexa-488. Figura 2. Vigília-diferença no marcador no fotorreceptor acoplamento peixinho é revelada pela técnica de corte de carga. Células fotorreceptoras gap junção neurobiotin acoplamento traçador foi extensiva à noite (B) e no dia seguinte à aplicação de Espiperona (10 mM), uma seletiva de dopamina D antagonista do receptor 2 (C), mas não no dia, sob condições de controle (A). D) intensidade relativa normalizada fluorescentes como uma função da distância dos cortes (indicado por setas em AC). E) val espaço constanteues obtidos a partir dos dados em experimentos D e outros (n = 4). *** P <0,001. Figura 3. Um exemplo representativo mostrando fluorescência na camada de células fotorreceptoras de uma retina de adaptação ao escuro da noite seguinte goldfish corte de carga com uma solução de ambos os neurobiotin e dextran rodamina. Rodamina dextran (mostrada em vermelho), que não se difunde através de canais de espaço aberto junção devido ao seu alto peso molecular (> 10.000 MW), apenas células marcadas perto do corte. Em contraste, neurobiotin (mostrado em verde) difundida através de junções e pode ser visto em células fotorreceptoras longe da corte. A localização do corte é indicado pela seta em cada painel. Barra de escala: 200 mM. Figura 4. Day noite diferemcia no fotorreceptor tracer acoplamento em retina de coelho é revelada pela técnica de corte de carga. Células fotorreceptoras gap junção neurobiotin acoplamento traçador foi extensiva à noite (B) e no dia seguinte à aplicação de Espiperona (10 mM) (C), mas não no dia, sob condições de controle (A). Na AC, vistas perpendicular da reconstrução 3D de fotorreceptores coelho perto do corte são mostrados. D) intensidade relativa normalizada fluorescentes como uma função da distância dos cortes. E) valores Espaço constante obtida a partir dos dados em experimentos D e outros (n = 3). *** P <0,001. Figura 5. Cut-loading revela que de adaptação ao escuro coelho células horizontais são tracer acoplados. Tanto do tipo A-(A) e tipo B (B) em células horizontais de adaptação ao escuro retinas de coelhos expostos homóloga neurobiotin acoplamento marcador.