باستخدام المنهج المقارن الأنواع المعنية بالتحقيق في البيولوجيا العصبية للردود الأبوية

1. تحديد نموذج حيواني الماوس دير كاليفورنيا (Peromyscus californicus) هو النموذج المثالي لاستكشاف ردود الأب. كما ترون ، هذا الفأر العرسان الجراء تماما كما تفعل الأمهات — هم يجثم فوقها حتى بحيث يبدو مثل الجراء والتمريض. مقارنة بين سلوك الفئران كاليفورنيا إلى أنواع من جنس نفسه ، الماوس الغزلان المشتركة (Peromyscus maniculatus) الذي يسلك القليل من الاهتمام في الجراء ، في محاولة للهروب كثير من الأحيان ، أو حتى الاعتداء عليهم. (انظر الشكل 1 للحصول على صور من هذه الأنواع التفاعل مع الجراء). مرة واحدة وقد تم التعرف على الأنواع ثم نموذج مختلف المجموعات التي ستنشأ الحاجة. في هذه الدراسة ، تستخدم الآباء البيولوجية ، وعذارى بلا خبرة الأبوة والأمومة ، والعذارى مع التعرض الجرو محدودة (الجرو المعرضة للآباء أو تعزيز) من كلا النوعين بحيث يمكن تقييم خصائص كل من الأب وميالا المكتسبة. في هذه الدراسة ولا سيما أننا يتعرض أيضا لجميع الفئات ماوس لعبة الجرو أن أؤكد أن التفاعلات الاجتماعية ومحددة لاستجابة الجرو وليس ممثلا لشيء وضعها في قفص (انظر الشكل 2). قبل التحقيق العوامل العصبية الحيوية ، فمن المهم للتأكد من أن الأنواع المختارة يحمل اختلافات واضحة في سلوك الفائدة. في هذه الدراسة ، يتم وضعها في قفص الذكور مع الجرو لمدة خمس دقائق وethogram السلوك الأبوي (انظر الجدول رقم 1 على سبيل المثال من ethogram) يستخدم لدرجة السلوكيات مثل الكمون من الاقتراب من الجرو ومقدار الوقت الذي يقضيه في الاتصال مع الجرو. إذا لاحظ الاستجابات العدوانية ، ويتم إزالة الجرو فورا. غالبا ما يتم تصويرها بالفيديو هذه الدورات حتى يمكن إجراء تحليل دقيق السلوكية التي أجريت في وقت لاحق. 2. إعداد أنسجة المخ بعد نضح القياسية لكل الماوس (البروتوكول المرفق) ، تتم إزالة العقول بحيث يمكن مقطوع في منطقة محددة من الفائدة (الدماغ تظهر). ويستخدم معيار دماغ الفأر الأطلس (اعرض أطلس) لتحديد موقع مجاور للبطين في النواة تحت المهاد ، وهي منطقة معروفة لتكون غنية في الخلايا المنتجة للneuropeptide من الاهتمام في هذه الدراسة — فاسوبريسين (AVP). ثم يتم حظر المخ وتركيبه على تجميد تشوك بحيث الأنسجة ستجمد قبل مقطوع مع مشراح. الدماغ هو مقطوع في وضع تقليم حتى يتم تحديد معالم محددة ، ثم يتم تعيين سمك الدماغ محددة ، و 30 ميكرون في هذه الحالة ، لأقسام المخ تستخدم للتحليل. توضع بعناية أقسام المخ جيدا في لوحات مليئة المالحة العازلة الفوسفات (PBS) ، (بروتوكول لبرنامج تلفزيوني المرفق ؛ يرجى ملاحظة أن هذا ليس سوى مثال واحد على بروتوكول كيمياء سيتولوجية مناعية قياسي). 3. كيمياء سيتولوجية مناعية طوال مختلف مراحل هذه العملية (انظر البروتوكول المرفق) ، فمن المهم أن تكون دقيقة pipetting المهارات لضمان قياسات دقيقة للمواد الكيميائية وغيرها من المكونات الهامة لهذه التقنية (اعرض pipetting طالب). الخطوة الأولى في هذه العملية هو غسل أدمغة الذي ينطوي على الاستعاضة عن برنامج تلفزيوني في لوحات بكثير عن ثلاثة إلى خمسة أضعاف ، وبين كل تغسل وتوضع على لوحات جيدا على الكرسي الهزاز لمدة 10 دقيقة (PBS تظهر الطالب استبدال لوحات ووضع جيد على الروك) . ثم يتعرض شرائح الدماغ إلى حل الضد الأولية وتخزينها في 4 درجات مئوية خلال الليل على الكرسي الهزاز (عملية عرض). بعد غسل آخر ، يتعرض للشرائح الدماغ إلى الضد الثانوية لمدة ساعة على مغني الروك في درجة حرارة الغرفة ، ثم غسلها مرة أخرى. القادم يتعرض لها العقل لإيجاد حل Avitin – البيوتين مجمع للتحضير للتصور من الخلايا الكيميائية العصبية إيجابية. للخطوة التصور النهائي ، يتعرض لها العقل لDAB. هذا هو منتج الخطرة ويجب دائما أن يكون التعامل معها بحذر. كما يتضح هنا ، شرائح الدماغ تبدأ في الحصول على أكثر قتامة أمام عينيك (اعرض العملية). بعد التعرض DAB ، والعقول تذهب من خلال سلسلة من الماضي ويغسل ثم وضعت بعناية على شرائح المجهر SUBBED وسمح لتجف بين عشية وضحاها (اعرض موضع شريحة الدماغ على شريحة ، انظر المرفقات للبروتوكول الشرائح SUBBED). ثم يتم مسح الشرائح من خلال سلسلة من يغسل الماء المقطر والكحول ، وأخيرا يجري المغمورة في Citrosolv قبل coverslipped وتخزينها في slidebox لحفظها في مكان آمن (إظهار الجوانب المختلفة لهذه العملية ، انظر المرفق لعملية تبادل المعلومات). 4. Neuroquantification بعد الشرائح قد جفت ، ويمكن تقييمهم مع برنامج neuroquantification المتخصصة. وتستخدم البرمجيات Bioquant هنا لتحديد الخلايا فاسوبريسين ايجابية والألياف في نواة مجاور للبطين من أدمغة فئران (عرض البرنامج على الشاشة… والمجهر). تم تحديد منطقة معينة من الاهتمام باستخدام خيارات القياسمن البرنامج لإنشاء المجال البصري للneuroquantification. من المهم أن يتم كميا متناسقة حجم الحقل البصري لكل حيوان (طالب تظهر القيام بذلك). هنا ملطخة بحزن أجسام الخلايا فاسوبريسين مناعيا ، والألياف واضحة. لأنه من الصعب الاعتماد أو تتبع هذا النسيج ، وهي ميزة خاصة من هذا البرنامج يستخدم لتحديد thresholding ضوء المبلغ الإجمالي للنسيج ملون إيجابيا داخل منطقة محددة من الفائدة. هذا thresholding يخبرنا كم من المنطقة المحددة الواردة فاسوبريسين إيجابية الأنسجة (تظهر قيمة البيانات على شاشة الكمبيوتر). 5. التحليل السلوكي إذا كان أكثر من مراقب واحد وسيتم تسجيله أشرطة الفيديو ، فمن المهم وضع التصنيفات بين الموثوقية للتأكد من أن المراقبين أن يحرز السلوك بطريقة متناسقة. سجل للدورة الفعلية ، ينبغي إعداد ورقة تسجيل السلوك للسماح لتسجيل سهل للسلوك أثناء جلسات المراقبة (انظر الجدول رقم 2 على سبيل المثال من التهديف ورقة انتشار). عن السلوكيات التي لا توجد ردود العرضية السريعة ، يمكن تحليل microsequencing تكشف الخفايا حول تطور ردود محددة. على سبيل المثال ، والاستمالة السلوك يتكون من سلسلة من ردود سريعة جدا. على الرغم من خيار واحد هو لمجرد تسجيل حضور ومدتها من الاستمالة ، وآخر هو وثيقة في سلسلة من الفعاليات المصاحبة لهذا الرد. باستخدام هذا البرنامج microsequencing والمراقبين نتيجة وجود سلوك معين في كل ثانية ، كما دفعت بواسطة برنامج (برامج العرض والفيديو). بعد جمع البيانات ، وتتحدد معالم الفائدة ويتم تحليل الدرجات المناسبة السلوكية. قد تكون المدة الإجمالية أمثلة من الوقت الذي يقضيه في الاتصال مع الجرو ، أو اضطرابات في عدد من تسلسل الاستمالة (اعرض كمبيوتر مع انتشار ورقة مع البيانات المدخلة عن كل حيوان). مرة واحدة وسجل سلوك من المهم أن أؤكد أن هذين النوعين معارضها استراتيجيات استجابة مختلفة للسلوك الفائدة في الدراسة. في هذه الحالة يجب أن الفئران الغزلان كاليفورنيا يحمل سلوك الأب أكثر من الفئران الغزلان المشترك. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن أن ترتبط تدابير سلوكية مختلفة مع التدابير المخ للحصول على عرض أكثر استنارة من التأثيرات ذات الصلة. 6. ممثل النتائج : للتحقق من صحة النموذج ، وينبغي أن البيانات تشير بوضوح إلى أن تنفيذ هذين النوعين بشكل مختلف في ما يتعلق بسلوك الفائدة. هنا ترى أن P. قضى وقتا أطول من الذكور californicus الاستمالة والرابض على الجراء ، واثنين من السمات المميزة لردود الأب (انظر الشكل 4). من أجل تحديد ما إذا كان المتغير neurobiologial الاهتمام المهم في ردود الأب ، وكان كميا مبلغ فاسوبريسين (AVP) إيجابية الأنسجة لعدة مناطق الدماغ ذات الصلة ؛ كما يمكن أن يرى ، والأب P. وكان أكثر الحيوانات californicus الأنسجة المناعية إيجابية في العديد من هذه المناطق في الدماغ. (انظر الشكل 5). في دراسة تتعلق باستخدام تحليل microsequencing ، كان الافتراض بأن الأب الفئران كاليفورنيا سوف يحمل القلق أقل من نظرائهم من عذراء ، وبالتالي ، فإن الآباء عندما تتعرض لرائحة الحيوانات المفترسة ، وعرض عدد أقل من انقطاع في تسلسل الاستمالة من الحيوانات البكر (انظر الشكل 6). الشكل 1 : (أ) ذكر الفئران كاليفورنيا اظهار ردود الأب تجاه الجرو مناوع الغريبة. (ب) ذكر الفأر الغزلان العارضة نهجا حذرا (التمدد الحضور) والاستجابة في تجنب وجود الغريبة مناوع الجرو. ملاحظة : في هذه التقييمات التفاعل الاجتماعي ، وإذا كان الذكور المعارض الاستجابات العدوانية تجاه الجرو ، والمجربون على الفور ضرب الجزء العلوي من القفص لإلهاء الذكور. في هذا الوقت يتم إنهاء الدورة ويتم إزالة الجرو ، وكشف عن أي إصابات ، وعاد إلى أمه. في المختبر لدينا ، وهذا نادرا ما يلاحظ مع P. ويلاحظ في بعض الأحيان ولكن مع الذكور californicus P. maniculatus ؛ مراقبة وثيقة والتدخل الفوري ، ولكن ، ومنع الأذى عن تطرأ على الحيوانات. الشكل 2 : فأر كاليفورنيا التفاعل مع ماوس لعبة ، ومعظم حاولت مضغه على هذه المحفزات. الشكل 3 : التصميم التجريبي للدراسة ، وهناك ما يقرب من 6 حيوانات في كل مجموعة عن كل الأنواع. الشكل 4 : رسم عملية كيمياء سيتولوجية مناعية. تينوقد لوحظت استجابات أكثر الأب (العريس ، كراوتش ، وأسرع النهج) في فئران كاليفورنيا ؛ لدى عودتهم 5 ردود الأبوية في ولاية كاليفورنيا والغزلان الفئران. وقد لوحظت أكثر تمتد يحضر (الاستجابة للضغط النفسي) في الفئران الغزلان. الشكل 6. تفاعلية مناعية فاسوبريسين في مناطق الدماغ المختلفة لكلا النوعين. كانت الفئران كاليفورنيا أكثر تلطيخ في الخلايا PVN والألياف. الشكل 7 : الأبوية الفئران أظهرت كاليفورنيا أقل انقطاع في تسلسل هذه الاستمالة في وجود رائحة حيوان مفترس من المجموعات المعرضة للالجرو وعذراء.