包装艾滋病毒或FIV的基于Lentivector表达结构与VSV-G假型病毒颗粒转导

1。 293TN细胞与包装质粒转染和表达建设种子7.0 – 8.0×10 6 293TN细胞每15厘米2 20毫升含DMEM培养基辅以4毫米L-谷氨酰胺，4.5 g / L葡萄糖，不含抗生素的胎牛血清（10％）的文化媒介文化板。成长为18-24小时，在37°C 5％CO 2，使转染时细胞密度达到60-80％汇合。在某些情况下，它可能是必要的种子细胞的几个板块，以获得足够高的靶细胞传导滴度。 对于每一个细胞板，添加1.6毫升的无血清DMEM蒸压2的毫升Eppendorff管。加入45μL的lentivector pPACKH1或pPACKF1和4.5微克建设吸取了DMEM培养液和混合。 添加到同一个管55μLPureFection。涡为10秒。孵育的DMEM-质粒，PureFection混合物在室温温度f或15分钟。 添加下拉明智和漩涡，轻轻均匀地分散在整个板块的组织培养板的DMEM培养液，质粒PureFection混合物。返回菜的孵化器和5％的CO 2增长在37°C。 有没有必要改变转染后的媒体。如果您lentivector结构表示如GFP荧光蛋白基因编码，检查你的细胞，显微镜下转染后12-24小时。你应该能够看到90％的GFP阳性细胞，表明转染成功。 收集到50毫升的无菌离心管细胞培养上清后48和72小时。现在这种细胞培养上清含有传染性pseudoviral颗粒。 （BSL-2类安全工作的建议指引。）离心15分钟，在室温下沉淀细胞碎片1500 XG。病毒上清转移到一个新的管，确保不打扰颗粒。 293TN细胞病毒包装已使用应弃置在生物危害容器，是不被用于进一步几轮病毒包装。 2。病毒上清的浓度新增1卷，冷（4℃）聚乙二醇病毒降水解慢病毒颗粒含上清，每4卷。大量的慢病毒颗粒的沉淀，可以实现与康宁250毫升聚丙烯离心管。反相几次管混合解决方案，但不涡混合物。 冷藏至少12小时的解决方案（长达4天是可以接受的），在4°C。不要摇晃或旋转管在制冷步骤。 离心30分钟，1500 XG上清/聚乙二醇混合物在4°C。慢病毒颗粒离心后，会出现如米色或白色颗粒在试管底部。倒出来的supernataNT。 取下吸液的所有痕迹，注意不要打扰在颗粒沉淀的慢病毒颗粒。残留的PEG的痕迹，它会稀释病毒（从而降低效价），但不会影响靶细胞的完整性，因为聚乙二醇是惰性的，而不是有毒。 用冷（4℃）重悬，并结合原体积的1/100的慢病毒颗粒，无菌磷酸盐缓冲生理盐水或培养液含有25毫米的HEPES缓冲。 分装到无菌低温瓶，直到准备使用储存于-70℃。 3。靶细胞病毒滴定和传导我们建议滴定前转导细胞的利益目标和适当的感染复数（MOI）计算实验之间的一致性的靶细胞的慢病毒颗粒。病毒滴定，我们建议使用HT1080细胞容易感染积极控制线。 PL缓解注意到，滴定协议，涉及与你已经打包的慢病毒颗粒的小等分转导HT1080细胞。滴度是已知的，一旦靶细胞的利益也可以转产生的慢病毒颗粒。一个建议滴定协议，可以发现在： http://www.systembio.com/downloads/manual_titer_kit_web.pdf 7。 板50000每口井的目标细胞的利息在24孔板中的细胞培养基。使用这些细胞通常培养英寸在其指定的培养条件下生长细胞过夜的媒体。细胞应该是转天之间的50至70％汇合。 转天，吸从细胞中的媒体。培养基与TransDux结合终浓度为1×（例如，2.5μL培养基TransDux到500μL）。然后转移的TransDux-CELL培养基混合，以每口井。 吸取了适当的病毒量，对应到每口井的靶细胞的最佳教学语言。如果最佳的教学语言是未知的，我们建议尝试了各种不同的水分（如莫伊容易感染的组织培养细胞，1，2和5和1，10和20为更难以内政部感染原代细胞）。如果慢病毒颗粒的浓度不知道（通过病毒滴定协议确定），不同的病毒量，可以尝试，如1，2和5μL的病毒。病毒与靶细胞可以保持长达72小时的接触。 进一步的实验与转靶细胞的利益可能会开始后，转72个小时，一旦病毒结构已整合到宿主细胞基因组。更改的介质，并根据他们的具体需要，通过靶细胞的利益。 4。代表结果<p类=“jove_step”的293TN细胞转染 293TN细胞密度开始是成功的病毒包装的关键。 293TN细胞必须融合在60 -80％之间的转天（ 图2）。 293TN细胞小于60％汇合，使他们成长为几个小时，然后再尝试转染。如果293TN细胞> 80％汇合，他们应该被转染前replated。 293TN细胞至少有90％如果使用lentivector表达GFP，应该荧光转染后24小时绿色，表明成功转染（ 图3）。如果低于90％的细胞GFP阳性，不进行下一个步骤，因为这表明，没有成功，转染和病毒滴度低。相反，板新293TN细胞并重新启动，使确定，293TN细胞在适当的细胞密度是前染。 293TN细胞可能会拉断的组织培养皿转染后48-72小时。这不会造成负面影响的慢病毒颗粒的生产。 滴定与HT1080细胞履行机构的全球超速滴定试剂盒，根据制造商的指示，可以计算出病毒滴度。该系统采用定量PCR WPRE序列的病毒整合到HT1080细胞的慢病毒载体来衡量和标准曲线进行比较，根据基因组参考序列，精确地测量每毫升传染性单位（图4）。 转导的靶细胞如果使用慢病毒颗粒表达组成性激活的GFP标记，GFP阳性细胞转导12-24小时内开始出现，如果传导反应工作。 GFP表达后应继续稳定的慢病毒结构集成到T他宿主细胞基因组。如果用不同的水分传导，GFP荧光应约匹配的教学语言，在低水分表明GFP荧光和较高的水分表明增加了GFP荧光（ 图5）。 图1。概述病毒的生产协议。混合的lentivector和pPACK包装质粒，并共同为293TN细胞转染。 48 -72小时后，收集病毒上清，用PEG，它沉淀病毒颗粒。滴定慢病毒颗粒后，他们可以使用转导靶细胞的利益。 点击这里查看大图 。 图2。期293TN细胞图像的对比度。细胞density应该是60-80％之间融合转一天。 图3。293TN细胞GFP阳性的荧光图像与Purefection，pPACKH1和结构lentivector编码绿色荧光蛋白转染后24小时。 图4。WPRE qPCR的结果和标准曲线，利用SBI的全球超速滴定套件来计算MOI和相应的滴度包装病毒颗粒。 图5。HT1080细胞荧光图像转慢病毒的数量不断增加。图片是从72小时后转。