Verfahren für die Ratte<em> In situ</em> Skeletal Muscle kontraktilen Eigenschaften

Ein. Einführung Die MacIntosh-Labor wurde mit der medialen Gastrocnemius Muskel-Präparat für mehrere Jahre, und davor die ganze gastrocnemius Muskel-Präparat, wie bei Dr. Phil Gardiner entwickelt. 1 2. Anästhesie Erwachsenen Sprague-Dawley Ratten (200-300 g) werden üblicherweise in unserem Labor für das Studium der kontraktilen Eigenschaften in situ verwendet. Die Ratte in einem Plexiglas-Geräte eingeschränkt werden, im Handel erhältlich, oder durch Abdecken mit einem Handtuch, und halten. Wir verwenden Ketamin / Xylazin, (100 mg · ml -1, jeweils) in 85:15 gemischt und Verwalten 0,1 ml pro 100 g Ratten intramuskulär 2,3 Gewichtsprozent. Natriumpentobarbital (50-60 mg · kg -1, intraperiteneal) oder Isofluran (2-3,5%, inhalativen) kann auch 4 verwendet werden. Während der Narkose wird mit Wirkung kann eine genaue Gewicht erhalten werden und die linke Hinterpfote Gliedmaßen rasiert. Dies ist auch ein guter time sicher sein, alle Elektronik eingeschaltet und bereit. Dazu zählen auch Rechner, DMS-Messverstärker, Ölheizung und andere. Überprüfen Sie für die Rückkehr der Reflex in regelmäßigen Abständen und ergänzen die Narkose nach Bedarf (0,05 bis 0,1 ml pro 100 g). 3. Initiieren Chirurgie Wir verwenden eine Plexiglas-Plattform, auf der die Ratte für eine Operation zu immobilisieren. Einfache Klebeband macht den Job. Achten Sie darauf, das Tier von links Hinterlauf wird nach rechts Vorderbein gestreckt. Fügen Sie einen Tropfen Schmiermittel auf die Augen. Wir verwenden Paraffinöl. Andernfalls werden die Augen austrocknen mit Ketamin-Anästhesie. Eine kleine OP-Leuchte ist nützlich. Dieser gibt genug Wärme, um zu helfen das Tier warm. Alternativ kann ein wasserlösliches Wärmedecke verwendet werden. Vergewissern Sie sich, Hornhaut oder Zehen-Pinch-Reflexe fehlen bevor Sie fortfahren. Steriler Technik ist nicht notwendig, da dieses Verfahren akut. Das Tier wird nicht aus der Narkose erholen. Wir einschläfern die Ratte mit BetäubungÜberdosierung (0,2 ml, intrakardialen), wenn alle Prozeduren beendet sind. Der erste Einschnitt durch die Haut von der Ferse zur Wirbelsäule. Wir verwenden Schere, da die Tiefe des Schnitts gesteuert werden kann und die Schere verwendet, um die Haut vor den darunter liegenden Geweben zu trennen. Ratten haben exzellente Hämostase, so lange, wie Sie große Blutgefäße zu vermeiden, Blutungen begrenzt. Die offenen Flächen mit isotonischer Kochsalzlösung getränkten Gaze abgedeckt, wann immer möglich. Nachdem die Haut von der darunterliegenden Bindegewebes getrennt wird, wird die oberflächliche Muskelschicht geschnitten. Achten Sie darauf, nicht zu gehen zu tief, man will nicht den Ischiasnerv oder Blutgefäßen oder den Muskel von Interesse beschädigen. Beginnen Sie über den Musculus gastrocnemius und schneiden proximal entlang der gleichen Linie wie die Hautschnitt. Peek unter zu finden und zu vermeiden den Ischiasnerv. Sobald Sie sehen, die Nerven haben, können Sie den Weg mit Ihrem Einschnitt folgen, sondern bleiben deutlich über dem Nerv. Es gibt eine klare Naht zwischen muszeuge. Dieses, und entlang dieser Naht in Richtung des Knies. Achten Sie auf und vermeiden Blutgefäße. 4. Bereiten Pilotbohrung in Femur für Knochen pin Durchtrennung der dünnen Schicht des Muskels über die Schwanzvene des Femurs, Aussetzen der blanken Knochen. Verwendung eines handgehaltenen Drehwerkzeug, bohren oder Schiebezange, (0,9 mm Kohlenstoffstahl bur), stellen eine kleine Vorbohrung durch die Rinde, und gerade in die Medulla. Nicht zu tief zu bohren, oder übermäßigen Blutungen führen wird. Dieses Loch wird später verwendet werden, um einen Knochen Pin platzieren, um die Oberschenkel auf dem myograph Basis immobilisieren. 5. Isolieren Innervation des medialen M. gastrocnemius Der nächste Schritt erfordert ein Binokular. Suchen Sie die Stelle, wo der Kniekehle Nerven verschwindet hinter der medialen M. gastrocnemius. Vorsichtig aus die verschiedenen Zweige verteilt, und schneiden Sie alles, was nicht innervieren nicht die mediale Gastrocnemius Muskel. Innervation durch Mikrostimulation bestimmt werden. Auf this der Bühne, auch sicherstellen, dass die oberflächlichen Filialen der Ischiasnerv geschnitten werden. Jetzt klar das Bindegewebe vom Ischiasnerv, so kann es in den Nerven Manschette (später) aufgeschoben werden. Achten Sie darauf, um den Nerv zu schonen. Jede Strecke des Nerven kann zu Unerregbarkeit führen und beenden das Experiment vorzeitig. 6. Isolieren Sie die Achillessehne und Gastrocnemius Stumpf mit gelegentlichen Hilfe von Schere, kann die Gastrocnemius-Muskel von anderen Geweben zu trennen. Die Sehne des M. plantaris kann unter der Achillessehne gezogen werden, gebunden und geschnitten. Die Krawatte wird lediglich verwendet, um beim Festhalten der Sehne und kann weggeschnitten werden direkt nach der Sehne geschnitten wird und der ausgewählt ist aus der plantaris gastrocnemius eine wesentliche Länge abgetrennt. Legen Sie eine Nr. 1 Seidenligatur um die Achillessehne und Krawatte in einem quadratischen Knoten. Nicht zu straff zu ziehen, oder die Sehne beschädigt wird. Wir verwenden Knochen rongeurs die calcan geschnitten eus, so dass ein kleines Stück Knochen noch an der Achillessehne befestigt. Halten Sie die Schnittflächen horizontal zu sein, dass die Knochen geschnitten wird, nicht nur die Sehne. Dies gewährleistet die Achillessehne der myograph kann angebracht später. Entlang der Unterseite des Gastrocnemius können die Soleus gesehen werden. Auch hier kann stumpf verwendet, um den M. soleus von der M. gastrocnemius zu trennen. Wir wollen die mediale Gastrocnemius isolieren, so ist es der einzige Muskel noch an der Achillessehne befestigt. Schneiden Sie die soleus Sehne, in der Nähe des distalen Ende. Dann können Sie trennen die medialen und lateralen Gastrocnemius Muskeln, und schneiden Sie die seitlichen Sehne, so dass nur die mediale Gastrocnemius an der Achillessehne. Ziehen des Musculus gastrocnemius laterale auswärts von der medialen zusammen etwa 50% seiner Länge. Jenseits dieser Länge schneiden sich die Fasern und Schäden werden von weiterem Ziehen führen. Überprüfen Sie, ob der Muskel ist frei von Bindegewebe. e "> 7. Schneiden Sie die Tibia Legen Sie eine Ligatur um den Schaft, knapp oberhalb der Mitte. Dies muss dicht sein, ohne Eingriff in das Gewebe. Eine zweite Schleife vor dem Heften verhindert ein Verrutschen. Wieder mit einem quadratischen Knoten zu sichern. Mit einer kleinen Säge, schneiden Sie die Unterschenkel entfernt. Dieser Schnitt sollte etwa in der Mitte des Schienbeins sein. Legen Sie eine scharfe Sonde in der Medulla der Tibia. Diese Sonde wird verwendet, um die Tibia auf der Basis myograph immobilisieren. Befestigen 2 Elastiken auf die Haut, mit Michel Clips. Diese und weitere Gummizüge wird verwendet, um die Haut zu halten rund um die Muskel einen Behälter, der mit warmen Paraffinöl gefüllt werden bilden. [OPTIONAL] 8. Legen sonometric Kristalle (optionaler Schritt) 5 Legen Sie das Tier auf einem Heizkissen bei niedrigen Einstellung. Eine Rektalsonde können falls nicht bereits zu diesem Zeitpunkt eingefügten eingefügt werden. Verwenden Sie einen kleinen Tropfen Paraffinöl zu schmieren. Verwendung Mikrostimulation, identifizieren die Enden eines fascicle innerhalb des Muskels. Poke eine 21-Gauge-Nadel in die Website sowohl der Ursprung und Ansatz des Muskels. Schieben Sie eine sonometric Kristall in das Loch mit der Nadel und Dichtung mit vet-Bindung chirurgische Kleber hergestellt. Verwenden Sie einen sehr kleinen Tropfen Kleber; darauf achten, dass es richtig ist, über den Kristall platziert. Auftragen des Klebstoffs auf einem Stück Papier Schnitt mit einem spitzen Winkel hilft bei der Verklebung genau. Wir setzen ein zusätzliches Einkristall in der Insertion des fascicle welche durch Mikrostimulation identifiziert wurde. [WEITER] 9. Montieren Sie in der Vorrichtung (siehe Abbildung 1) Positionieren Sie die Ratte auf dem myograph Basis, mit dem Tibia-Sonde orientiert Hebel. Legen Sie die Sonde in die Halterung, um das Bein zu immobilisieren. Ziehen Sie die Haut an den Seiten, um einen Behälter zu bilden und befestigen Sie sie mit Gummibändern. Set Bohrkrone (1/16 inch th) in den Femur, mit dem PilotLoch, das während der OP-Vorbereitung erstellt wurde. Stellen Sie sicher, dass Sie die Oberschenkel auf dem vorderen Teil unterstützt, wie Sie den Bohrer (in einem Stift vice) als Bruch des Oberschenkelknochens platzieren führen kann, endet das Experiment vorzeitig. Bringen Sie den Pin vice zu einem Cross-bar, um die Oberschenkel zu immobilisieren. Setzen Sie den distalen Stumpf der Ischiasnerv durch den Nerven stimulierend Manschette (Kathode in Richtung Muskel) und tuck wieder nahe am Ursprung des Muskels. Verbinden Sie den Stimulator auf diese Drähte. Bringen Sie die Achillessehne auf den Hebel, die DMS-Sensoren drauf hat. Tie snuggly, aber lassen Sie etwas Platz für eine spätere Einstellung. Sicherstellen, daß die Ausrichtung des Muskels ist senkrecht mit dem Hebel. Füllen Sie den Behälter von der Haut mit warmen Paraffinöl gebildet. Schalten Sie die Wärmelampe und Position Schilde Alufolie über den Kopf des Tieres gemacht und den Kraftaufnehmer. Zusätzliche Folienabschirmungen kann notwendig sein, um sicherzustellen, die Kerntemperatur des Tieres nicht EXCEed 38 ° C. Die Länge des Muskels kann eingestellt werden, bis Durchhang des Strangs von der Verbindung zwischen den medialen gastrocnemius und den Kraftaufnehmer entfernt wird. 10. Stellen Sie maximale Spannung und Bezugslänge Während der Muskel wird aufgewärmt, richten Sie den Stimulator und testen Sie die Stimulation Spannung. Es ist wichtig zu sein, dass die Stimulation in sehr kurzen Impulsdauer gesetzt wird. Wir verwenden 50 ms. Maximale Spannung sollte weniger als 1 V. Ab 0,5 V, erhöhen Spannung bis twitch Amplitude nicht erhöht. Maximal Spannung ist die niedrigste Spannung, die alle motorischen Einheiten aktiviert. Wir in der Regel auf das Doppelte der maximalen Spannung zu stimulieren, oder 3 V je nachdem, was höher ist. Typischerweise werden Experimente mit dem Muskel an der Länge, die den größten twitch Kontraktion gibt beginnen. Ein Zucken ist mit einem einzelnen Stimulationsimpuls erhalten. Der Muskel Länge durch ca. 1 mm für einen anderen twitch erhöht. Dies wird solange wiederholt Amplitude twitchsteigt. Sobald twitch Amplitude abnimmt, wird die Länge zu dem, der die größte Amplitude hat twitch zurückzusenden. Nach dieser anfänglichen Einstellung der Länge, testen wir das System mit dem, was wir als eine "Konditionierung tetanische Kontraktion". Der Stimulator wird, um Impulse bei 200 Hz liefern für 500 ms. Lieferung dieses Stimulation wird in einem völlig verschmolzen tetanische Kontraktion führen. Die Kraft, die durch den Muskel erzeugt wird anziehen alle Verbindungen, einschließlich der Knoten auf den Muskel. Nach einer geeigneten Rest für Dissipation Potenzierung 4 ist die Referenzlänge des Muskels zurückgesetzt (siehe Teil 9.2). Normalerweise wird die Klimaanlage tetanische Kontraktion wird einige fascicle Länge Verkürzung erlaubt haben, so der Muskel wird gedehnt ein wenig, um wieder auf die Länge, die den größten Amplitude twitch Kontraktion gibt werden. 11. Initiieren Sie das Experiment Ein typisches Experiment gehören Länge Abgleichent-und / oder Stimulation mit einer Vielzahl von Mustern von Stimulation. Die Datenerhebung kann es sich nur Kraft oder Kraft, mit der Länge, Faszikel Länge und Elektromyogramm. [OPTIONAL] 12. Force-Frequenz-Verhältnis 2 Stellen Sie den Zug Dauer lang genug, um ein Plateau von Gewalt bei einer beliebigen Frequenz von Interesse zu erreichen. Die maximale isometrische Kraft in der medialen gastrocnemius bei 200 Hz erreicht. Zug Dauer muss mindestens 200 ms betragen, mehr ist besser für niedrigere Frequenzen, sondern in gewisser Ermüdungserscheinungen führen, wenn mehrere Kontraktionen verwendet werden, um das gesamte Spektrum der Kraft-Frequenz-Beziehung zu bestimmen. Wir verwenden in der Regel Kontraktionen bei 0, 20, 40, 60, 80, 100 und 200 Hz. Dieser Bereich von Frequenzen ermöglicht die volle Bandbreite der Kraft-Frequenz-Beziehung beschrieben werden. Eine geeignete Pause zwischen den Kontraktionen muss erlaubt Ermüdung zu vermeiden (1-10 min). 13. Force-Länge relationship 6 Wobei die geschätzte optimale Länge festgelegt wurde, kann eine kraftschlüssige Beziehung Länge durch systematische Anpassung der Länge des Muskels von -4 mm bis 4 mm mit einem Servo-Motor-Vorrichtung bestimmt werden. Dies sollte mit maximaler Stimulation (200 Hz) werden, aber wir haben festgestellt, dass sehr kurze Kontraktionen werden das gleiche gilt optimale Länge 7 zu ergeben. Submaximalen Kontraktionen, wie Zuckungen, können verwendet werden, aber dies wird eine unterschiedliche Länge-Abhängigkeit der Stärke 8 zu ergeben. Ein wichtiger Aspekt der Bestimmung der Kraft-Länge Beziehung ist die Notwendigkeit, den passiven Kraft am fascicle Länge, bei der die gemessene Kraft tritt abzuschätzen. Aktiven Kraft wird als die Differenz zwischen der gesamten Kraft und der entsprechende passive Kraft berechnet. Da die parallelen elastischen Strukturen der passiven Kraft ertragen und diese sind in Reihe mit den Serie elastischen Strukturen muss die passive Kraft Beitrag zur gesamten Kraft der Reihe abnehmen elastic Strukturen während einer Kontraktion 3 gestreckt. Sobald das passive Kraft für alle relevanten Muskellängen bekannt ist, kann der entsprechende passive Kraft, mit kontinuierlichen Messung der Länge unter Verwendung fascicle sonomicrometry oder durch Schätzung der Übereinstimmung des Messsystems und die In-Reihe-Strukturen des Muskel-Sehnen-Einheit geschätzt werden. Wenn dies nicht geschieht, werden die optimale Länge der Vorbereitung und Kraftspitzen, unterschätzt. 14. Kraft-Geschwindigkeits-Beziehung 9 Wenn Sie möchten, dass die Kraft-Geschwindigkeits-Beziehung zu bestimmen, müssen Sie die Kraftaufnehmer zu einem System, das die Kontrolle über entweder Last oder Geschwindigkeit der Längenänderung ermöglicht befestigen. Die einfachste und kostengünstigste Methode ist, um den Luftdruck zu verwenden, um Verkürzung zu einer kontrollierten Last zu beschränken. In unserem System wird der Muskel an dem Hebel auf einer Seite des Drehpunkts befestigt ist und der Luftdruck behindert Längenänderung auf der anderen Seite. Eine Länge Sensor needs auf Arbeitnehmer, so dass Sie in der Lage, um die Änderung im Muskel Länge während isotonische Kontraktionen zu erkennen sind. Diese Anordnung ermöglicht afterloaded Kontraktionen mit pneumatischen Widerstand. Dual-Tanks können isometrische Kontraktion mit Freisetzung in einer isotonischen Belastung ermöglichen. Insgesamt 15-20 Kontraktionen sollte erhalten werden, mit Belastungen von fast unbelasteten maximale isometrische Kraft. Beim Anpassen der Daten an eine Gleichung, sollte Lasten über 90% des nicht isometrische 9 verwendet werden. 15. Repräsentative Ergebnisse: Beispiel Kontraktionen sind in Abbildung 2 dargestellt. Diese Kontraktionen wurden erhalten, um die Kraft-Frequenz-Beziehung zu illustrieren. Berechnung der Peak aktive Kraft dieser Kontraktionen und Auftragen der aktiven Kraft gegen die Frequenz, Abbildung ergibt 3; die Kraft-Frequenz-Beziehung. Die Daten in Abbildung 2 dargestellt, kann der Gleichung angepasst werden: AF = c / (1 + e ((aF) / b) + d); AF ist aktiven Kraft, F Frequenz und a, b, c und d Konstanten sind. Für die Ratte gastrocnemius mediale ist die halbmaximale Frequenz der Stimulation typischerweise 50-60 Hz in nicht ermüdet Muskels 2. Ergebnisse werden eng an der Linie durch die obige Gleichung beschrieben. Abbildung 1 Vorrichtung und Muskel-Set-up:. Pneumatische set-up auf der linken Seite angezeigt, isometrische auf der rechten Seite. Der Hebel-System auf der linken Seite angezeigt wird, um der Übersetzung Tisch befestigt, wenn dynamische Kontraktionen gewünscht werden (in Anlehnung an 13). Der Schrittmotor wird durch einen Computer (aus 14) gesteuert wird. . Abbildung 2 Überlagerte isometrische Kontraktionen: 20, 40, 60, 80, 100 und 200 Hz. Die Amplitude des 200 Hz Kontraktion 8,13 N. les/ftp_upload/3167/3167fig3.jpg "/> . Abbildung 3 Force-Frequenz-Verhältnis: Active Kraft der Kontraktionen in Abbildung 2 aufgetragen werden und die Linie repräsentiert die Linie der beste Passform.