Cryoconservation d'embryons de souris par base d'éthylène glycol vitrification

Le schéma global de l'expérience est montré dans la Fig. 1. 1. Préparation des réactifs Rendre le milieu de base (ici en tant que connue PB1) dans une bouteille de verre de 100 ml selon le tableau ci-dessous: MW mM mg/100ml NaCl 58,4 136,98 800,0 KCl 74,6 2,68 20,0 KH 2 PO 4 136,1 1,47 20,0 Na 2 HPO 4 0,12 H 2 O 358,14 8,04 288,1 MgCl 2, 6H 2 O 203,3 0,49 10,0 <td> Glucose 180,2 5,56 100,0 Pyruvate de Na 110 0,33 3.6 CaCl 2, 2H 2 O 147 0.9 13,2 La pénicilline G 6,0 (environ) Faites le Ficoll-sucrose (FS) solution: Ajouter les substances chimiques suivantes à 14 ml de PB1 solution dans un tube de 50 ml. Ficoll 70 6,0 g Saccharose 3,424 g BSA 42,0 mg Mélanger Ficoll 70 et du saccharose dans PB1 solution et bien agiter jusqu'à dissolution complète. Après vérification de la dissolution complète ci-dessus, ajouter la BSA sur la surface de la solution et le conserver à4oC jusqu'à ce BSA est complètement dissous (> 4 heures ou jusqu'au lendemain). Faire la solution d'équilibrage (EFS20) et la solution de vitrification (EFS40) dans un tube de 50 ml: EFS20: 20% (v / v) d'éthylène glycol, 24% (p / v) de Ficoll, et de 0,4 mol / L de saccharose dans PB1 avec BSA EFS40: 40% (v / v) d'éthylène glycol, 18% (p / v) de Ficoll, et de 0,3 mol / L de saccharose * en PB1 avec BSA * Pour les embryons de la souche BALB / c ou ICR, augmenter la concentration de saccharose à 0,9 mol / L de saccharose, car ils sont plus sensibles aux cryodamage 6. EFS20 solution EFS40 solution L'éthylène glycol 1 ml 2 ml Solution de FS 4 ml 3 ml Stériliser la solution par filtration en utilisant une filte 0,45 umR. Faire aliquotes dans des tubes de 5 ml en polystyrène et conserver à 4 ° C. Ils peuvent être utilisés pendant environ 6 mois. Préparation de la solution d'embryon dégel contenant 0,75 M de saccharose (TS1) Dissoudre 7,7 g de saccharose dans PB1 (préparé à l'étape 1.1) et porter le volume total à 30 ml. Mélanger en secouant doucement jusqu'à complète dissolution du saccharose. Ajoutez 90 mg de BSA sur la surface de la solution et laisser reposer jusqu'à dissolution complète. Stériliser la solution par filtration. Aliquoter et conserver à 4 ° C. Ils peuvent être utilisés pendant environ un mois. Note: TS1 peuvent également être préparés à partir de M2 ​​disponibles commercialement. Dissoudre 7,7 g de saccharose dans M2 et porter le volume total à 30 ml. Mélanger en secouant doucement jusqu'à complète dissolution du saccharose. Stériliser la solution par filtration. Aliquoter et stocker à 4 ° C. Ils peuvent être utilisés pendant environ un mois. TS2 (solution dégelcontenant 0,25 M de saccharose): Diluer 10 ml avec 20 volumes TS1 ml de PB1 ou M2, le cas échéant. Aliquoter et conserver à 4 ° C. Ils peuvent être utilisés pendant environ un mois. 2. La vitrification d'embryons de souris à 2 cellules Préparer deux cellules d'embryons de souris par accouplement naturel ou conventionnel dans les techniques de fécondation in vitro. Aliquote de 50 ul EFS40 dans un cryotube. Ci-après, exécuter le reste de la procédure de vitrification à la température ambiante. Aliquote de 50 pl d'EFS20 sur le fond de 35 mm ou 60 mm en plastique plat de Pétri. Transfert jusqu'à 30 embryons à l'aide d'un EFS20 capillaire en verre avec seulement le montant minimum du milieu de culture. Démarrer une minuterie pendant 2 min. Remarque: les embryons Placer sur le fond de la goutte. Cela rend efficacité de la déshydratation des embryons. Vérifiez la morphologie des embryons par un stéréomicroscope. Embryons déshydratés montrent une morphologie ratatinée, comme indiqué dans la Fig. 2A.Si elles ne sont pas déshydratés assez d'attendre pour plus d'1 ou 2 min. À environ 1,5 min, ramasser les embryons dans le menu déroulant EFS20 avec seulement le montant minimum de la solution. Transférez-les dans le cryotube EFS40 préparé en 2,1 étapes. Note: Pour les meilleurs résultats, ajuster le calendrier de ramasser des embryons de telle sorte que tous les embryons peuvent être transférés dans EFS40 à environ 2 min. Attendre 1 min. Mettez le cryotube directement dans l'azote liquide (LN2). 3. La décongélation des embryons de souris vitrifié 2-cellules Avant de décongélation, préparer un plat avec 10 gouttes ul de milieu de culture embryonnaire des embryons récupérés (voir l'étape 3.13). Couvrir le plat avec de l'huile et placer dans un incubateur à CO 2 jusqu'à son utilisation. Note: Bien que tous les médias pour la culture d'embryons de routine peuvent être utilisées dans cette expérience, nous recommandons médias avec plus osmolarité tel que le milieu M16. TS1 chaud à 37 ° C. Mettez un masque visage et cryogloves. Ouvrez la LN 2 tank et récupérer un cryotube contenant des embryons. Ouvrir rapidement le haut du tube et jeter LN 2. Attendre 30 secondes pour éviter le gel des TS1 à l'étape suivante. Utiliser une pipette 1000ul d'ajouter 850 l de TS1 (37 ° C) dans le tube et mélanger la solution par pipetages douce (environ dix fois en 25 secondes) jusqu'à ce que la solution est uniformément dissoute. Transférer la totalité du volume du tube pour un plat en plastique de 60 mm de Pétri (ou un verre de montre) (figure 3A). Remarque: Les embryons doivent être manipulés à la température ambiante (22-25 ° C) jusqu'à ce qu'ils soient placés dans un incubateur à CO 2 à l'étape 3.14. Démarrer une minuterie pendant 3 min. A environ 2 min dans TS1, secouez doucement la parabole jusqu'à le milieu contenant les embryons est étalé sur la surface de la parabole (figure 3B). Note: Ceci aidera les embryons vont vers le bas parce qu'ils sont flottants près de la surface lors de son transfert à TS1. Mettez trois gouttes de 50 pl d'TS2 sur ee plat (figure 3C). Après 3 min dans TS1, vérifier la morphologie des embryons par un stéréomicroscope, ils devraient être légèrement rétrécie. Voir la morphologie des embryons en plus tôt (figure 2B) et plus tard (figure 2C) en TS1. Remarque: Si les embryons sont encore gonflées, les garder dans TS1 pour plus de 1 à 3 min. Ramassez les embryons et les transférer à la première goutte de TS2 (Fig. 3D). Démarrer une minuterie pendant 3 min Après 3 minutes, le transfert des embryons à la baisse de secondes, puis à la troisième baisse (Fig. 3E). Transfert des embryons dans le milieu de culture préparé à l'étape 3.1. Les embryons sont dans la forme représentée dans la Fig. 2D. Placez-vaisselle dans un incubateur à CO 2. Environ 10 minutes plus tard, le transfert des embryons à la baisse prochaine du milieu de culture pour laver le saccharose qui a été reporté de TS2. Poursuivre la culture dans un incubateur à CO2 jusqu'au transfert d'embryon. Remarque: Le transfert EmbryOS pour les oviductes des femelles receveuses au jour de décongélation. Longue culture in vitro peut diminuer la viabilité des embryons chez certaines souches de souris. 4. Les résultats représentatifs: In vitro – et in vivo-développement des embryons après décongélation est présenté dans les tableaux 1 et 2. Les avantages de ce protocole sont les chances de survie élevé d'embryons après décongélation et son large applicabilité à différentes souches de souris. Souche Nombre total de tubes No. d'embryons vitrifiés Réformé (n ° (%)) Morphologiquement normaux (n ° (%)) Développement d'blastocystes (n ° (%)) C57BL/6J 20 400 397 (99) 394 (99) 342 (87) BALB / ca 15 300 296 (99) 282 (95) 238 (84) ICR 24 480 474 (99) 443 (93) 398 (90) Tableau 1. In vitro-développement de vitrifiés et décongelés embryons dans des souches de souris commune Condition d'embryons Nombre de femelles receveuses No. d'embryons transférés Sites d'implantation (n ° (%)) Des jeunes vivants (n ° (%)) Fraîches 12 180 141 (78.3) 110 (61.1) Vitrifié 16 242 202 (83.5) 125 (51.7) Tableau 2. In vivo, le développement des vitrifiés et décongelés embryons chez des souris C57BL/6J. Figure 1. Le schéma d'ensemble de l'expérience, y compris l'équilibration, la vitrification, et la décongélation des embryons. Figure 2. La morphologie des embryons à chaque étape de décongélation. Figure 3. Dégel procédure d'embryons. Toutes les procédures sont réalisées à température ambiante. (A), ajouter 850 l de TS1 (37 ° C) dans un cryotube et le transfert de la totalité du volume de la solution dans le cryotube sur un plat en plastique. A cette époque, les embryons chercher gonflées comme indiqué dans la Fig. 2B. (B), étaler la solution sur la surface du plat en le secouant doucement. (C), 50 gouttes Placer trois pl d'TS2 sur le plat en plastique. (D), le transfert des embryons pour la première goutte de TS2. Après 3 minutes, les embryons chercher shurunken comme indiqué dans la Fig. 2C. (E), les transférer sériement dans le reste TS2 gouttes et puis au milieu de culture.