In vivo Lever endocytose gevolgd door zuivering van levercellen door leverperfusie

1. Excisie van de lever (overgenomen van PO Seglen 12 en R. Blomhoff 13 met wijzigingen 14,15) Voeg 10 mL 30% isofluraan in polyethyleen glycol met een petrischaaltje in een gesloten 5,5 L kamer. Het allerbeste is om 10-15 minuten te wachten na toevoeging van isofluraan om een ​​gestabiliseerde sfeer te creëren binnen de kamer. Plaats een rat in de verzegelde kamer en laat het toestel niet onder narcose. Volledige effecten van de verdoving worden duidelijk wanneer het dier slap, reageert, en vertoont diepe ademhaling. Plaats 2 mL van isofluraan in polyethyleen glycol in een aantal katoenen ballen op de bodem van een 30 ml spuit buis. Plaats de rat op zijn rug op een luier bedekte tray en plaats de spuit buis over de snuit. Bevestigt onmiddellijk diepe verdoving door het bevochtigen van de buik met 70% ethanol. Laat niet het dier sterven door een overdosis isofluraan. Met behulp van schaar en pincet bandage, bloot de hele abdominaal holte. Zoek de vena porta en, met behulp van een tang, trekken twee strengen van chirurgische zijde of polyester draad (ligatuur) onder de vena porta direct boven de mesenteriale branche. Trek de pincet en bind een losse halve knoop. Met behulp van een tang onder de vena porta en voorzichtig terug te trekken naar rechtzetten van de ader, canule de ader met een Insyte Autoguard katheter (18 GA, 1,3 x 300 mm, BD Biosciences) of soortgelijke katheter. De katheter moet gaan enkele mm verder dan de lus gevormd door de draad. Ingetrokken en de naald te verwijderen door het vrijgeven van de veerbelaste trigger op de katheter. Bloed zou moeten beginnen sijpelt omhoog naar de catheter aangeeft juiste ligatuur plaatsing. Draai naar beneden de halve knoop en zet het vast met een andere halve knoop. Sever ofwel de vena cava inferior of dalende aorta (aorta abdominalis) om bloed afvoer van de bloedsomloop. Begin spoelen van de lever met zuurstofrijkTBS bij 37 ° C in het bloed (blancheren) te verwijderen bij een debiet van 20 ml / min. De lever moeten keren van een roodachtig paars naar een leem kleur. Terwijl de lever is spoelen, accijnzen de lever door het wegsnijden van het maagdarmkanaal en het bindweefsel. Het is belangrijk niet te kwellen de lever of te doorboren van de Glisson van de capsule. Leg de lever op een kunststof net over een trechter die het mogelijk maakt buffers worden verzameld en gerecirculeerd. Buffers op dit punt mag niet worden gerecirculeerd, maar vloeien in het afval beker. Vlissingen mag niet langer duren dan 10 minuten. (Fig. 2A). Bereid de endocytose oplossing nodig in stap 2.1. 2. Internalisatie van 125 I-SA-b-Hep (of een andere geschikte gelabelde ligand) Tot 50 ml RPMI media in een klein bekerglas, toe te voegen aan een uiteindelijke concentratie 0,05% BSA en 0,01 mCi 125 I-SA-b-Hep of andere gepaste label ligand voor endocytose. Bevestig deze beker aan de apparatus om te zorgen voor zuurstof. Zet de pomp, zet de inlaat buis, en dan aan de pomp gaat u bij 20 ml / min. Als de gelabelde RPMI nadert de lever, schakelt u de pomp en laat overtollige vloeistof in de trechter en slang afvoer. Plaats de afvoer slang in de media beker om recirculatie van de gelabelde media dan de mogelijkheid en de pomp opnieuw te starten. Laat vloeistoffen om door de lever recirculeren voor niet meer dan een uur. Tijdens deze internalisatie stap, moet u de temperatuur in de lever is stabiel door het bedekken van het en de voorbereiding van de collagenase voor de spijsvertering. 3. Vertering van de lever door collagenase spijsvertering Vers opgelost en gefiltreerd (0,45 pm) collagenase (100 mg / kg rat gewicht) moet worden toegevoegd aan 2 Buffer in een totaal volume niet groter zijn dan 60 ml bij 37 ° C. Het volume is afhankelijk van de lengte / interne volume van de slang en dient dienovereenkomstig te worden aangepast. Stop de pomp en de uitwisseling van deinlaat slang van de media beker aan de TBS. Spoel de lever gedurende 2 min bij 50 ml / min die het mogelijk maakt voor het losmaken van de desmosomal cel knooppunten die calcium afhankelijk zijn. Terwijl de lever is spoelen, wisselen de media bekerglas met het bekerglas met collagenase op het apparaat. Direct na het spoelen, begint de vertering met collagenase in een circulatie-lus bij een debiet van 20 ml / min gedurende maximaal 15 minuten. Sinds collagenase partijen verschillen per lotnummer, variaties in de hoeveelheid en het tijdstip van de spijsvertering moeten worden geoptimaliseerd voor elke nieuwe hoop collagenase. Collagenase is ook afhankelijk van calcium. Zet de pomp en zet de buffer-en gasleidingen van Flask A naar B. Flask het effluent lijn Transfer van de afvalcontainer, Flask B (Fig. 2B). Stop de pomp, verwijder dan de katheter en overdracht van de lever om een ​​schotel met 20-30 ml buffer 1. Schil de rug van de Glisson het kapsel van de lever en schud de cels die in de vloeistof. Als de vloeistof ondoorzichtig met cellulair materiaal, overdracht van de cellen door een 100 um mesh, gevolgd door filtratie door een 30 um mesh en dan in een 50 ml conische op ijs. Voeg meer Buffer 1 tot en met de lever en blijven schudden cellen van de lever matrix, het overbrengen van de vloeistof aan de mesh filters en kegelvormig. Herhaal de stappen 3,7 tot 3,9 tot er geen meer cellen kunnen worden losgemaakt met een redelijke schudden van de lever. 4. Hepatocyt en SEC zuivering Centrifugeer de 50 ml conicals bevattende cellen op 150 xg gedurende 3 minuten. naar pellet de hepatocyten. Breng de vloeistof fractie die niet-parenchymcellen om verse 50 ml conicals op ijs. Was de hepatocyten de pellet worden resuspenderen in Buffer 3 en het herhalen van de stappen 4.1 en 4.2 nog drie keer. Aan het einde van de wasbeurten, de pellets zijn ≥ 97% zuiver hepatocyten. Voor het verkrijgen van de SEC, centrifuge alle buizen containing gepoolde supernatant (met HSC, SEC, en KCS en enkele kleine hepatocyten) op 200 xg gedurende 10 minuten. bij 4 ° C. Aspireren van de buffer en resuspendeer alle pellets in 5 ml RPMI / BSA bij 4 ° C. Het zwembad van het cellen samen in twee tubes en voeg RPMI / BSA tot een volume van 35 ml. Centrifugeer de conicals op 100 xg gedurende 3 minuten. Verzamel de top 25 ml vloeistof en over te dragen aan een schoon 50 ml conische. Resuspendeer de pellet in de resterende 10 ml media en voeg weer 25 ml koud RPMI / BSA en centrifugeer op 100 xg gedurende 3 minuten. Herhaal de stappen 3,8 en 3,9 keer meer, gooi de celpellet en onderste 10 ml media. Centrifugeer de supernatents tot pellet seconden, KCS, en HSC op 200 xg gedurende 10 minuten. bij 4 ° C. Bereid drie 50 ml buisjes met 20 ml 25% Percoll in PBS op ijs. Onderlaag met 15 ml 50% Percoll in elke buis. Resuspendeer de cel pellets in een totaal volume van 30 ml RPMI / BSA. Zorgvuldig overlay each verloop met 10 ml van cellen en centrifugeer op 900 xg gedurende 20 min bij 4 ° C. SEC en KCS zeer nauwe drijfvermogen dichtheden en zijn op de 25/50%-interface. HSC's worden meestal op de 25% / media-interface als gevolg van hun hogere drijfvermogen als het opslaan van vet cellen. Eventuele resterende hepatocyten en bloedcellen hebben de lagere buoyancies en gepelleteerd. Aspireren van boven naar beneden de buurt van de 25/50%-interface en gooi dit materiaal. Verzamel de cellen in de 25/50%-interface en over te dragen aan een frisse conische met koude RPMI. Het uiteindelijke volume moet ~ 40 ml te verdunnen de Percoll worden. Centrifugeer de conische bij 350 xg gedurende 10 min bij 4 ° C om pellet de cellen. Resuspendeer de cellen in ~ 10 ml voorverwarmd RPMI met 100 U / mL Penicillin/100 g / ml streptomycine en plaats cellen in een zuur gewassen glazen petrischaaltje of kristalliserende schotel. Incubeer de cellen gedurende 15 minuten. bij 37 ° C in een weefselkweek incubator. Rock of krul de plaat een beetjeen dan het verzamelen van de SEC in het supernatant. Het KCS zich te houden aan het glas veel sneller dan secs. Als alternatief kan SEC worden gescheiden van KCS door immunopurification met behulp van anti-CD31 antilichamen of anti-Stabilin2/HARE geconjugeerd aan magnetische korrels. Levensvatbaarheid en celaantallen kan worden beoordeeld door trypan blauw uitsluiting met behulp van een hemacytometer of met behulp van een geautomatiseerde cel tegen te gaan. Cultuur van de SEC op met fibronectine gecoate plastic schaaltjes bij 37 ° C, 5% CO 2, RPMI/0.25% BSA met 40 ng / mL VEGF, 100 U / ml penicilline, 100 ug / ml streptomycine of met hepatocyten geconditioneerde media. Hepatocyten, KCS, en de SEC kunnen beoordelen zijn voor de internalisering van gelabeld materiaal door het gebruik van een gamma-teller en het normaliseren van het totale cellulaire eiwit of door microscopie (indien fluorescent gelabelde) met behulp van deze kweekmethoden. 5. Representatieve resultaten: Hepatocyt zuivering is ≥ 97% en SEC zuivering is typicbondgenoot ≥ 95% met deze methode. Excisie van de buikholte, canulatie van de poortader, en blancheren van de lever alle dient te geschieden binnen een minuut voor het beste resultaat. HARE/Stabilin-2 is een specifieke receptor op de lever SEC en wordt niet uitgedrukt in andere lever celtypen. In deze steekproef werden cellysaten van zowel de hepatocyten en SEC gescheiden door 5% SDS-PAGE en gemerkt met een monoklonaal antilichaam tegen beide isovormen van Stabilin-2 (afb. 3). Niet-gefractioneerde heparine ingespoten in de bloedbaan wordt geklaard door de lever 16. Klaring is voornamelijk uitgevoerd door de lever SEC in tegenstelling tot hepatocyten en KCS 17. De Stabilin-2/HARE receptor is de belangrijkste ruimte receptor die bindt en internaliseert heparine in seconden 18. In ons voorbeeld hebben we gelabeld heparine met een biotine-tag op de carboxylaat groep van GlcNAc / NS. De biotine werd geconjugeerd met jodiumhoudende streptavidine voor de detectie van de geïnternaliseerde heparine proteoglycan. Injectie van de gelabelde heparine, gevolgd door verbloeding 30 minuten na de injectie stelt ons in staat om te controleren welke organen deze vorm van heparine te internaliseren. In deze korte tijd interval, de lever is de primaire klaring orgel (afb. 4). Om beter te begrijpen welke type cel is verantwoordelijk voor de klaring, voegden we 125 I-SA-b-Hep aan RPMI media aangevuld met 0,05% BSA en liet het aan via de lever circuleren gedurende 20 minuten. Naar aanleiding van collagenase spijsvertering en cellulaire zuivering, is de overgrote meerderheid van gelabelde heparine geïnternaliseerd door de SEC in tegenstelling tot hepatocyten (afb. 5). Figuur 1. Basic lever architectuur. SEC vormen de muren van de sinusoiden en zijn normaal (opening kleine clusters van cirkels). Stellaatcellen (HSC's) zijn te vinden in de ruimte van Disse, in tegenstelling tot Kupffer cells (KCS), die normaal aanwezig zijn in de microvasculatuur van de sinusoïden. Hepatocyten bezetten de andere kant van de ruimte van Disse. Figuur 2. Schematische voorstelling van de perfusie apparaat. A) Set-up van apparatuur tijdens het spoelen / wassen van de sinusoïden van de lever. TBS is in een 1 L kolf. B) Een 125 ml fles met ~ 60 ml Buffer 2 met collagenase wordt gebruikt voor de spijsvertering van de lever in een gesloten circuit. Het effluent lijn is ook veranderd van de afvalcontainer, B, inhoud door middel van een inkeping in de rubber stop. De zuurstof lijn wordt niet ondergedompeld in de buffer met collagenase (fles B) schuimvorming te voorkomen. De stoppers op elke fles zijn ingesneden om een ​​efficiënte overdracht van het effluent lijn toe te staan ​​en tot een verhoogde druk van de zuurstof-gas te voorkomen. Figuur 3. </sTrong> Hepatocyt preparaten zijn niet verontreinigd zijn met sec. Gelijke hoeveelheden van cellysaten uit gezuiverde batches van hepatocyten (baan 1) en SEC (laan 2) werden van elkaar gescheiden door 5% SDS-PAGE en geblot op nitrocellulose. Monoklonaal antilichaam # 30, die specifiek is tegen beide isovormen (315 kDa en 190 kDa) van HARE/Stabilin-2 werd gebruikt om de lysaten sonde. Figuur 4. Verdeling van gelabeld heparine in organen. Ratten werden geïnjecteerd via de laterale staartader met 125 I-SA-b-HEP wacht 30 minuten en daarna exsanguinated. Bloed werd verzameld om zo om geen organen kunstmatig hoog lezingen te geven. Tellingen per minuut (CPM) van elk orgaan werden genormaliseerd tegen het gewicht van het orgel in gram. Figuur 5. Bedrag van gelabelde heparine in hepatocyten en sec. RPMIk media met 125 I-SA-b-Hep mocht laten circuleren door een intacte lever voor 20 min, gevolgd door collagenase spijsvertering en cellulaire zuivering. Gelijke hoeveelheden van de hepatocyt en SEC cel proteïne lysaten werden gekwantificeerd met de Bradford assay en geteld door een gamma teller. Figuur 6. Kupffercellen worden gescheiden van SEC door hechting op glas. De cellen werden geplaatst in een met zuur gewassen glazen kristalliseren schotel en mag gedurende 15 minuten hechten bij 37 ° C, 5% CO 2. De supernatent met niet-cellen gehandeld werd voorzichtig rondgedraaid en geplaatst in een centrifugebuis. Lysaten van beide aangehouden cellen op glas (baan 1) en van niet-naleving cellen (laan 2) werden van elkaar gescheiden door 8% SDS-PAGE, geblot en gemerkt met een antilichaam tegen CD163 die specifiek is voor Kupffercellen. Figuur 7. SEC uitgeplaat op fibronectine gecoate kunststof 6-well schalen werden gedurende de nacht geïncubeerd in RPMI aangevuld met 0,1% BSA. Fase contrast beelden werden genomen op (A) 100x en (B) 200x vergroting.