の選択熱帯熱マラリア原虫寄生虫

一般的な推奨事項人間の脳の微小血管内皮細胞（HBEC – 5i）の文化は、以前は次の6に記載されている、8。P.熱帯熱マラリア原虫は、9と同様に培養した。 HBEC – 5iおよびP.両方熱帯熱マラリア原虫の培養は常に無菌状態に維持する必要があります。すべての試薬は37℃であらかじめ温めたされるべき我々は定期的にPCRによるマイコプラズマ汚染10（Minevera Biolabs社、製造元の指示に従います）をチェックすることをお勧めします。プロトコールを図1に要約される。 1。内皮細胞のルーチン培養必要な試薬を準備します。 準備する培地 試薬 数量 "不完全なDMEM" DMEM – F12ハム 500ミリリットル ＆ニッポン放送p; L -グルタミン200mmの 5ミリリットルペニシリン/ストレプトマイシン100X 5ミリリットル NaOHを1M 1.3ミリリットル（7.4にpHを調整） "完全DMEM" "不完全なDMEM" 450ミリリットル胎児ウシ血清熱不活化 50ミリリットル内皮細胞成長サプリメント 5ミリリットル文化、5％CO 2で37℃インキュベーターで10ミリリットルDMEM完全培地で通気孔25センチメートル2フラスコでHBEC – 5I。 継代数の細胞がコンフルエントになる。吸引して、古い培地を除去し、二回DMEM不完全培地または組織培養グレードのPBSを（のCa 2 +およびMg 2 +フリー）予め温めておいた37℃使用して洗う予め温めておいた試しに1mlの追加フラスコの全体をカバーし、37〜2分間インキュベートするpsin – EDTA（0.025％トリプシン、0.5 EDTA）、スワール℃に細胞の少なくとも90％が分離されていることを倒立顕微鏡下で確認してください。必要に応じて、軽く接着細胞を取り除くために、フラスコの底をノック。 15ミリリットルコニカルチューブにトリプシンおよび転送細胞をブロックするDMEM完全培地10mlのを追加。室温（RT）で300 gで4分間遠心。 上清を捨て、DMEM完全培地10mlのでペレットを再懸濁します。徹底的に細胞を再懸濁するために上下ソリューションをピペット。 新しい培養フラスコに細胞懸濁液の1または2 mlを加え、文化を維持するために新鮮な培地の8ミリリットルを追加します。倒立顕微鏡下で毎日文化の成長を評価し、それが黄色に変わる前に、2,3日ごとに1培地を変更してください。 2。選択のための内皮細胞の準備前のSelectIOの日の2日前まで nは、一つ（またはそれ以上）60ミリメートルペトリ皿に滅菌PBSで希釈したフィブロネクチン（濃度2μg/ cm 2）を加える。 37℃で5〜20分間の一品をインキュベート° Cは、その後の月のために4℃で保存し、一度、再使用可能なフィブロネクチンソリューションを、削除してください。 継代数の細胞は、セクション1.3で説明。 1.5〜。と仮定すると100パーセントコンフルエント細胞が分離し、10ミリリットルDMEM完全培地（1.6節。、コンフルエントが低い場合に培地の同等のボリュームで再懸濁し、コンフルエンシーが80％だった場合、例えば 8ミリリットルで再懸濁）に再懸濁し、懸濁の1.5ミリリットルに追加フィブロネクチンコートしたペトリ皿とDMEM完全培地の別の1.5ミリリットルの細胞。 インキュベーターでシードペトリ皿を置きます。注：理想的には、細胞集密度は二日後に選択の時点で約90％になります。 省略可能 。 HBEC – 5iはアクティブにするには、前の選択に50μg/ml24時間の最終濃度でTNF（腫瘍壊死因子）サイトカインを加える。 e_title"> 3。 熱帯熱マラリア原虫のルーチン培養必要な試薬を準備します（ここで下の表を参照）。白血球除去フィルター（一般的なマラリア原虫の培養のための出版物11"マラリア研究の方法"を参照）を通過させることによって全血（グループO +）を分離することによって、ヒト赤血球（RBC）を準備します。 5分間400gで遠心分離と10mlのRPMI不完全でそれらを再懸濁することにより回RBCを洗ってください。 4で洗浄赤血球を保つ° Cの不完全培地で50％のヘマトクリット値で。 準備する培地 試薬 数量 "不完全なRPMI" RPMI 1640（炭酸水素） 500ミリリットル HEPES 1M 12.5ミリリットルグルコース20パーセント 5ミリリットル</TD> L -グルタミン200mmの 5ミリリットルゲンタマイシン50mg/ml 250μlの NaOHを1M 0.7ミリリットル（7.2にpHを調整） "RPMIを完了" "不完全なRPMI" 450ミリリットルヒト（非免疫）プール血清 50ミリリットル文化P. 37 2％のヘマトクリット値とインキュベートでRPMI完全培地℃、3％CO 2、1％O 2、および96％N 2。と熱帯熱マラリア感染赤血球寄生虫（図2）の開発の段階を評価するためのギムザ塗抹標本11は毎日行います。 定期的に（およそ週一回）ソルビトール処理12で文化を同期させる。前日に選択アッセイ、5％の寄生虫以上のリングステージの培養のための目的（理想的に少なくとも10％）。 4。 P.の選択内皮細胞へのcytoadhesionのための熱帯熱マラリア原虫 HBEC – 5iは文化が（理想的には90％）50から100パーセントでコンフルエントになるはずながら、アッセイの日には、寄生虫の文化は、色素栄養型の段階（ 図2）（理想的に10％の寄生虫）になっているはず。寄生虫文化の30μlの血中血球容積はHBEC – 5iはペトリ皿ごとに必要とされる。 寄生虫の文化の1.5ミリリットル（5分間500g）を遠心分離によって二回寄生虫を洗ってください。上清を捨て、焼きたての、暖め、DMEM不完全培地10mlので懸濁します。洗浄をもう一度繰り返す。 1％BSAを持つ不完全なDMEM中1.5ミリリットルと30μlの血中血球容積を再懸濁します。 二回培地を吸引し、不完全なDMEMの3ミリリットルを追加するHBEC – 5iはコーティングされたペトリ皿を洗ってください。 37 HBEC – 5iは皿とインキュベート寄生虫の解決° 75分のためのCを追加。インキュベーション中に（30および60分後）二回寄生虫を再懸濁します優しく四方の料理だけでなく、時計回りと反時計回りに揺動して。 インキュベーション後、暖かいDMEM不完全培地、および穏やかなロッキングの3mlを追加するには、プラスチック製パスツールピペットを用いて、培地を吸引し皿を5回洗浄する。多くの皿が使用されている場合は、そのような37℃の水で満たされた大きなフラスコ℃と、暖かい表面にそれらを保つ倒立顕微鏡下で料理を確認してください。多くの非感染赤血球がまだ表示されている場合、上記のようなより多くの洗浄を行います。汚染の危険を避けるために、非常に慎重にペトリ皿を扱う。 皿から培地を除去し、新鮮なuRBCの40μlの血中血球容積で暖かいRPMI完全培地の3ミリリットルを追加します。 それは、3分間、気密インキュベーションチャンバー内にガスを料理を置き、37℃で一晩インキュベーターにチャンバーを配置。 翌日、セクション4.4で説明したと同様の方法で、RPMI不完全培地で洗浄することによって寄生虫を収穫。しかし、より積極的に。ケーpはすべての培地は、15ミリリットルコニカルチューブに（再懸濁されたRBCを含む）を使用。すべてRBCが皿から削除されていることを倒立顕微鏡下で確認してください。 ペレット寄生虫は、5ミリリットルRPMI完全培地に再懸濁し、上清を、破棄し、通常の培養用フラスコ中で混合物を配置。 5。代表的な結果選択されていない寄生虫はHBEC – 5I（図3A）に結合する低レベルを示しています。このように、選択の第1ラウンド後に、非常に少数の寄生虫を収穫され、それが選択の第二ラウンドのための十分な寄生虫に到達するための培養の月間ほどかかる場合があります。選択の各ラウンドの後、より多くの寄生虫は、内皮細胞に結合し、選択はより短い時間間隔で繰り返すことができます。選択の4-5ラウンド後に、高結合寄生虫の個体数が得られる（図3）。 私たちの手で、HBEC – 5IまたはTNF活性HBEC – 5i]のHB3 – HBECの結合は、SIMであったILARレベル（データは示さず）。 ここで記述されたプロトコルは、4 P.でテストされています熱帯熱マラリア原虫株 ：HB3、IT/FCR3、3D7とDD2（表1）。唯一の後者は、さらに選択の5ラウンドの後、HBEC – 5Iにバインドできない証明した。 HB3の寄生虫はまた、ヒト皮膚と肺微小血管内皮細胞（HDMECとHPMEC）への細胞接着のために選択した。ここに記載された方法を使用して、選択の4ラウンド、後に、高結合人口はHDMECとHPMEC（図4）の両方が得られた。 図1。選考プロセスの概要。 P.の図2。発展段階熱帯熱マラリア原虫は赤血球に感染する 。ギムザ塗抹標本では1000X倍率で顕微鏡下で可視化した。 図3。HBEC – 5i]の結合寄生虫の典型的な例 。 （A）青の層は、ギムザでグルタルアルデヒドとステンドグラスでHBEC – 5iは固定です1000X倍率で顕微鏡下で可視化した。 uRBCとバインドされていないiRBCが洗い流された後、撮影された。左側のパネルでは、単一のPを示しています。 HBEC – 5Iにバインドされている熱帯熱マラリア原虫 HB3（未選択）寄生虫。右側のパネルではHB3 – HBEC寄生虫は5ラウンドのために選択されていた。 （B）データは2つの独立した実験、重複で実行される各の平均を表しています。内皮細胞当たりの結合寄生虫の数をカウントした。 表1。成功 HB3もTNF活性化HBに選択されていることをHBEC – 5I（注） への結合のために選択された熱帯熱マラリア原虫株の概要EC – 5iは。選択の5ラウンドの後、DD2株が選択されていない- DD2に比べHBEC – 5Iへの結合の増加を示さなかった。 図4 Pの結合選択の4ラウンドの前と後の熱帯熱マラリア HB3皮膚に寄生虫（HDMEC）と肺（HPMEC）内皮細胞、。HDMECとHPMECのための培養液がわずかに異なりますが（供給者の指示を参照）、選択のために使用されるプロトコルがあるとして同一であったHBEC – 5iは。 400Xの倍率で撮影した画像。 試薬の名前 会社 カタログ番号 コメント DMEM – F12ハムシグマ D6421 DMEM完全培地用 L -グルタミン200mmのGIBCO 25030 DMEMおよびRPMI完全培地用ペニシリン/ストレプトマイシン100X（10000単位/ mlおよび10mg/ml） ScienCell 0503 DMEM完全培地用胎児ウシ血清熱不活化 ScienCell 0025 DMEM完全培地用トリプシン- EDTA（0.025％トリプシン、0.5 EDTA） ScienCell 0103 内皮細胞成長サプリメント ScienCell 1052 DMEM完全培地用組織培養は、60 mm X 15ミリメートルのペトリ皿を扱わ BD 353002 ヒトフィブロネクチンミリポア FC010 濃度2μg/ cm 2で使用 TNF R＆Dシステム 210 – TA オプションは、50μg/ mlで使用 RPMI 1640 ロンザ BE12 – 167F RPMI完全培地用ゲンタマイシン50mg/ml ロンザ 17 – 518Z RPMI完全培地用 HEPES 1M ロンザ BE17 – 737E RPMI完全培地用 HDMEC ScienCell 2000 一次細胞株 HPMEC ScienCell 3000 一次細胞株 HBEC – 5I フランシスコCandal（fcandal@cdc.gov）から入手 表2。マテリアル