Una técnica de la litografía plasma versátil se ha desarrollado para generar patrones estables de superficie para guiar la unión celular. Esta técnica puede ser aplicada para crear redes de células, incluyendo las que imitan los tejidos naturales y se ha utilizado para el estudio de varios tipos, distintos de células.
Manipulación sistemática de un microambiente celular con una resolución de la micro y nanoescala es a menudo necesaria para descifrar varios fenómenos celulares y moleculares. Para cumplir con este requisito, hemos desarrollado una técnica de la litografía de plasma para manipular el microambiente celular mediante la creación de una superficie modelada con tamaños que van desde 100 nm a milímetros. El objetivo de esta técnica es ser capaz de estudiar, de forma controlada, el comportamiento de las células individuales, así como grupos de células y sus interacciones.
Este método de litografía de plasma se basa en la modificación selectiva de la química de la superficie de un sustrato por medio de proteger el contacto del plasma de baja temperatura con un molde físico. Esta protección selectiva deja un patrón químico que puede guiar a la adhesión celular y el movimiento. Este patrón o plantilla de la superficie, se puede utilizar para crear redes de células, cuya estructura puede imitar a la que se encuentra en la naturaleza y produce un ambiente controlable para las investigaciones experimentales. La técnica es muy adecuada para el estudio de fenómeno biológico que produce patrones estables en la superficie transparente de sustratos poliméricos en forma biocompatible. Los patrones superficiales durar semanas o meses y puede guiar la interacción con las células de largos periodos de tiempo que facilita el estudio a largo plazo de los procesos celulares, tales como la diferenciación y la adaptación. La modificación a la superficie es principalmente de naturaleza química y por lo tanto no introduce interferencia topográficos o física para la interpretación de los resultados. Asimismo, no se recurra a ninguno de sustancias duras o tóxicas para alcanzar los patrones y es compatible para el cultivo de tejidos. Además, puede aplicarse para modificar los diferentes tipos de sustratos poliméricos, que debido a la capacidad de sintonizar sus propiedades son ideales para y se utilizan ampliamente en aplicaciones biológicas. La resolución a alcanzar también es beneficioso, como el aislamiento de procesos específicos como la migración, adhesión o unión permite observaciones discretas, claro en la única a nivel multicelular.
Este método ha sido empleado para formar redes de tipos de células diferentes para las investigaciones relacionadas con la migración, la señalización, la formación de tejido, y el comportamiento y las interacciones de las neuronas instruido de cargos en una red.
El método de investigación de células que aquí se presenta permite la creación de patrones complejos de redes multicelulares que imitan las estructuras biológicas, así como proporciona un método para producir estímulos que son subcelular en la naturaleza que a su vez facilita la investigación de los comportamiento de las células agrupadas y las respuestas de células individuales a factores ambientales. El uso de este método es simple, pero fuerte, ya que puede realizarse rápidamente con equipos de bajo costo en el mismo laboratorio como el cultivo celular. También es muy sensible a la célula, permite una fácil observación de la conducta resultante y es, por naturaleza estable durante largos períodos, lo que permite la investigación de comportamiento a largo plazo de células. Es, además, permite una amplia gama de experimentos a realizar, ya que es compatible con muchos tipos de células y puede crear patrones arbitrarios. La estabilidad a largo plazo de la técnica deriva del hecho de que la funcionalización superficial impartida por el plasma es parte de la superficie y no es una capa o una capa de otros que pueden ser eliminados o degradados. Si se mantiene bajo agua, este tipo de modificación puede conservar su capacidad de orientación para celulares meses.
La parte más crítica de la experiencia necesaria para garantizar resultados significativos es el de crear el modelo maestro que en última instancia será utilizado para la orientación de la célula. Si este patrón no está bien diseñado, las células no se ajustará adecuadamente a la estructura y no puede producir un comportamiento útil. Parámetros como el ancho de línea, el espacio de patrones, y otros pueden influir mucho en la compatibilidad de células con un patrón determinado, y por lo general una serie de parámetros como pueden ser creados en la fotomáscara inicial para detectar el diseño más apropiado.
Otros parámetros importantes relacionados con la ejecución del patrón incluyen la creación del molde, el mantenimiento de un ambiente libre de polvo, la siembra de células y la esterilidad general de cultivo de células. La creación del molde se puede efectuar por los pasos sucesivos traslados que se llevan a cabo para permitir repetir PDMS arrojando un molde de epoxi. El molde de epoxy se crea debido a que no se degradará de la misma manera como resistir el moho con estructuras pequeñas, de alta relación de aspecto en fundición repetida. Si el moldeo por transferencia se hace correctamente, las dimensiones y el rendimiento no se verá afectada, pero si se hace incorrectamente, como por el mal de desgasificación, la curación incompleta, o calor excesivo, las burbujas, la aspereza y la deformación de un patrón puede ocurrir que afecta el resultado final. En relación con el mantenimiento de un ambiente libre de polvo, el moho se debe mantener lo más limpio posible, ya que el polvo puede interferir con el contacto adecuado entre el molde de trabajo PDMS y la superficie y por lo tanto adecuada protección de plasma y los patrones químicos. La densidad de siembra de las células también deben ser optimizados para asegurar que ni las células de muy pocos o demasiados habitan en el área de diseño y la esterilidad se debe mantener para evitar la contaminación bacteriana y otras de las células que se utiliza.
La técnica también se pueden incorporar otros elementos como la microfluídica, microelectrodos, sondas y mecánica. Esto ofrece estímulos adicionales a las células con el fin de reproducir mejor los distintos estados fisiológicos durante la experimentación y el trabajo futuro se centra en estudiar los efectos de estas combinaciones
The authors have nothing to disclose.
Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
Plasma Cleaner And Vacuum Chamber | Harrick Plasma | PDC-001 | |
Inverted fluorescence and phase contrast microscope | Nikon | TE2000-U | |
Microscope stage top incubator | AmScope | Model TCS-100 | Modified to include an enclosure that supplies an appropriate atmosphere |
Polystyrene Petri dish | VWR | 25384-090 | |
Polydimethylsiloxane (PDMS) | Dow Corning | Sylgard 184 | |
Epoxy | Devcon | 2 ton clear epoxy #14310 | |
Cell culture media | Various | Media follows standard formulations for cell type | |
Retinoic acid | Sigma | R2625 |