ヒト人工多能性幹細胞をトランスフェクトしNucleofecting

我々のプロトコルはGeneJuice（EMD）とAMAXA nuclefector装置を用いてヒトの性IPSCのクレオを用いてヒトの性IPSCをトランスフェクトするためのプロトコルが続くフィーダーフリー培養に人間性IPSCを適応させる方法で始まります。 注：以下の手順は、無菌層流フード内で実行されます。すべてのメディアおよびソリューションは、37℃以上、特に断らない限り起動する前に室温に戻しています。 1。フィーダーフリーシステムに人間性IPSCの確立以前にフィーダー細胞上で維持人間性IPSCは、分割Geltrexコーティングされた皿に移して、フィーダーフリートランスフェクションの前に2つの通路を維持することができる。 4℃で一晩Geltrexを解凍Geltrexコーティングを準備するには、冷たいDMEM中で解凍Geltrex 1:50に希釈します。優しくソリューションを混ぜる。 注：Geltrex、マトリゲルなどが基底膜MATRの可溶性形態であるixはネズミEngelbreth·ホルム·スウォーム（EHS）腫瘍細胞から精製した。あるいは、マトリゲルをフィーダーフリー人間IPSC文化を確立するために細胞外マトリックスとして使用することができます。 Geltrex溶液（35-mmの1ミリリットルウェル）で培養ウェルの表面全体を覆​​う。 37℃Geltrex付きコート井戸℃で1時間インキュベーター。 ほとんどの細胞が剥離し始めるまで通路人間性IPSCに、ウェル当たりaccutaseの1ミリリットルを加え、1分間37℃でインキュベートする。 ほとんどの細胞が剥離し始めるまで通路人間性IPSCに、ウェル当たりaccutaseの1ミリリットルを加え、1分間37℃でインキュベートする。 細胞がゆっくりと渦プレートを10から15にガラスビーズを追加します。ノックアウトDMEM / F12の2ミリリットルを加え、穏やかにひいて粉にする。 10 mlの遠心チューブに細胞懸濁液を移す。 室温で3分間800rpmで細胞をスピン。 人間IPSCペレットはそのままにして、チューブから上清を吸引します。優しくチューブをフリック細胞ペレットを分散させる。 コー​​ティングされた井戸からGeltrexを削除します。 優しくSTEMPROの適切な音量で人間IPSCペレットを再懸濁します。 ）増殖速度に応じて、フィーダーのウェル間で配布しています。人間性IPSCは、1:2〜1:6の分割比で継代することができる。 慎重に所定の位置5％CO 2インキュベーター、慎重にスワールプレートのウェルを越えた細胞の均一な分布を確実にするために。 細胞まで、毎日のフィード細胞は（細胞が80％コンフルエントに達したとき）を再度分割する準備が整いました。 1:2の分割比で新しいGeltrexコーティングされた井戸の上に通路人間性IPSC（ステップ1.3から1.9）。小さなコロニーが形成され、よくGeltrexコーティングされたトランスフェクションの前に均等に分配されるべきである。 2。 GeneJuiceと人間性IPSCのトランスフェクション細胞（6ウェルプレート上で増殖）最適なトランスフェクション効率を達成するために、トランスフェクションの日に合流、約40〜50％であるべきである。それは翌日まで細胞培地を変更する必要はありません。 滅菌済み1.5mlエッペンドルフチュー​​ブに100μlのKO-DMEM/F12を準備します。 27μlのGeneJuiceトランスフェクション試薬を追加します。よく混ぜる。 5分間室温でインキュベートする。 4μgのプラスミドDNAを追加。 15分間室温でチューブをインキュベートする。プラスミドの選択が最適なトランスフェクション効率のために重要です。我々はプロモーター5（pCAG-EGFP）をCAGによって駆動増強された緑色蛍光タンパク質（EGFP）を有するプラスミドを使用しています。 CAGプロモーターと人間性IPSCにおける転写活性であり、したがって、これらの細胞に導入遺伝子の発現を駆動するために使用することができる強力なプロモーターである。我々の手では、プラスミドの線形化は、トランスフェクション効率に影響を与えていないようでした。 細胞やスワールプレートにGeneJuice-DNA混合物を追加します。十分に人間性IPSCでトランスフェクション混合物の接触を高めるために5分間1200rpmで（ 'spinoculation'メソッド）でプレートを回転させる。 37＆で細胞をインキュベート度、Cで一晩。 翌日、トランスフェクション効率を監視する。 安定したトランスフェクションのために、新鮮なSTEMPROで翌日培地を変更してください。 48時間 – 24の後に適切な抗菌薬の選択を追加します。 3。人間性IPSCのヌクレオフィーダまたはGeltrex上に成長させた人間性IPSCはクレオのために使用することができます。しかし、我々は強く高い細胞生存率と回復を確実にするために、マウス胚線維芽細胞（MEF）またはヒト包皮線維芽細胞（HFF）のフィーダにnucleofected人間性IPSCを再播種をお勧めします。少なくとも2万個の細胞は、ヌクレオ以下の高い細胞生存率を達成するために使用されるべきである。 一夜フィーダー細胞を用いてヒトIPSCノックアウト血清代替（KOSR）メディアをインキュベートすることにより、フィーダー細胞馴化培地（CM）を準備します。 CMを24時間ごとに収集します。 注：フィーダー層を製造するために使用される任意のマウス系統（例えば、BLK6、CF1とMF1など）foを使用するのに適していますrはCMを作る。 クレオの日には、少なくとも1時間、10μMROCK阻害剤との人間性IPSCを事前に処理します。 滅菌済み1.5mlエッペンドルフチュー​​ブにヒト幹細胞ヌクレオ液の82μlを準備します。 18μlのサプリメント（1）を加える。よく混ぜる。 5分間37℃で溶液をインキュベートする。 プリ暖かいフィーダー細胞馴化培地（CM）および0.25％トリプシン/ EDTAを37℃ボンネットの下に、prelabel 1滅菌15 mlコニカルチューブ。 慎重nucleofectedする人間IPSC文化からメディアを削除します。優しくウェル当たり2ミリリットル1Xリン酸緩衝液（PBS）で細胞を洗浄する。 PBSを吸引除去。ウェルあたりの0.25％トリプシンを1mlを加える。 3分37℃で細胞をインキュベートします。 そっと千ミリリットルピペットチップを用いて細胞をひいて粉にする。すべての人間性IPSCが完全に切り離されていることを確認するために井戸の底を洗います。ラベルの付いた15mlコニカルチューブに細胞懸濁液を移す。 注：単一のcにトリプシン処理ellsは厳密に避けるべきである。細胞の約三つ子から成っていた細胞が唯一の細胞の小さな塊に外れなければなりません。細胞の小さな塊（セルトリプル）は、細胞のその後の取扱い中に単細胞に解離することになります。 トリプシンを不活性化するために9ミリリットルMEFのメディアを追加します。 3分間800rpmで細胞をスピン。注意深く上清を吸引し、細胞ペレットをそのままにしておく。 ステップ3.3からヒト幹細胞ヌクレオソリューションの温めておいた100μlの細胞を再懸濁する。 1ミリリットルピペットチップを用いてヌクレオキュベットにセルを転送します。 キュベット内の細胞懸濁液にプラスミドDNA4μgのを追加します。穏やかな旋回により細胞とDNAを混ぜます。ボンネットの表面に二回キュベットをタップします。 ヌクレオホルダーにキュベットを挿入します。プログラムは、B-016を使用しています。ボタンXを押すことによって、細胞をNucleofect < クレオプロセスがあるときのcomplet>が表示されますED（通常は1〜5秒しかかかりません）。他のヌク​​レオプログラムの使用（-023-033とU-023）は、人間性IPSCからEGFP陽性細胞の10％未満が得られた。 提供されるパスツールプラスチック製のピペットを使用してキュベットからnucleofectedセルを取得。滅菌済み1.5mlエッペンドルフチュー​​ブに温めておいたCMと、ROCK阻害剤でそれらを再懸濁することにより細胞を回収する。細胞が回復するように10分間37℃で細胞をインキュベートします。 1ミリリットルピペットチップを用いてフィーダー層上に滴下転送細胞。 37℃で一晩細胞をインキュベートします。 翌日、トランスフェクション効率を監視する。に安定して導入遺伝子を発現するトランスジェニック人間性IPSCの安定したクローンを導出し、CMとROCK阻害剤で翌日培地を変更してください。 48時間 – 24の後に適切な抗菌薬の選択を追加します。 4。代表的な結果： <stチョロン>図1。pCAG-EGFPでトランスフェRiv1人間性IPSCの顕微鏡写真。 （A）のEGFP発現細胞がRiv1 Geltrex 12時間トランスフェクション後にGeneJuiceを使用してトランスフェクションした。 Riv1人間性IPSCのコロニーは、B-016（B）と-023（C）のプログラムを使用してヌクレオ以下フィーダー上で平板培養し、形成された。 （D）はユビキタスeGFP発現で安定EGFP発現人間IPSCコロニーがGeneJuice由来。 （E）を安定的にトランスフェクトRiv1人間性IPSCは、胚様体の分化過程で恒常eGFP発現を保持した。