Il nostro piano sperimentale è schematicamente rappresentata nella Figura 1. 1. La crescita e la preparazione di cellule staminali neurali (NSC) per il trapianto Il EnStem-una linea cellulare (EMD Millipore) è stato utilizzato in questo studio. NSC sono regolarmente convalidato dal fabbricante per alti livelli di espressione dei marcatori multipotenti nestina e Sox2, e basso livello di espressione del marcatore pluripotenti Oct-4, insieme alla capacità di differenziarsi in diversi fenotipi neuronali e di mantenere un cariotipo normale dopo passaggi multipli. Nelle nostre condizioni di crescita, queste NSCs visualizzata abbondante espressione di Sox2 e nestina e mantenuto la loro capacità di differenziare, come descritto in precedenza 1. NSC sono stati coltivati in poli-L-ornitina (20 mg / ml) e laminina (5 mg / ml), colture di tessuti rivestiti fiaschi trattati. Le cellule sono state coltivate in terreno di espansione neurale (Millipore) arricchito con L-glutamina (2 mM) e fibroblasti di basefattore di crescita (bFGF; 20 ng / ml). Monostrati seguace di NSC sono stati diversi passaggi a giorni alterni (1:2) con accutase come agente dissociazione 1. Per gli studi di trapianto, NSC sono stati utilizzati a passaggi sotto i 10. NSC sono stati etichettati con 5-bromo-2'-deossiuridina (BrdU), completandola con i mezzi di crescita mM BrdU 4 per tre giorni prima del trapianto. Per verificare l'etichettatura BrdU indice (cioè percentuale di cellule BrdU positive), le cellule sono state placcate su vetrini da camera e trattati per il rilevamento BrdU utilizzando le normali approcci immunocitochimica. Celle utilizzate per il trapianto di routine mostra etichettatura degli indici superiore al 90% 2. In alternativa, trapiantato cellule staminali umane sono state rilevate mediante l'essere umano marcatore specifico antigene nucleare (HuNu) 2. Il giorno del trapianto, accutase e media espansione neurali sono stati pre-riscaldato in un bagno d'acqua a 37 ° C. Le celle sono stati messi in mezzo di incubazione (media espansione neurale contenente 10 mMdi Y-27632) per un'ora. Y-27632 (ROCK inibitore, EMD-Calbiochem) è stato utilizzato per migliorare la sopravvivenza di NSCs post-trapianto. Dopo un'ora, i mezzi di incubazione è stato rimosso e le cellule sono state trattate con accutase per 5 minuti. Dopo questo trattamento breve aggiungere un volume equivalente di media espansione neurali di neutralizzare il ceppo accutase e le cellule attraverso un colino 70 mM cellulare. Contare le celle con un emocitometro e preparare 1,0 x 10 5 NSCs vivere per microlitro in media di iniezione (media espansione neurale contenente 10 mM di Y-27632, 40 ng / ml bFGF, 20 ng / ml BDNF). Le cellule sono state memorizzate nei media espansione neurale (come descritto in 1.5) e tenuta in ghiaccio fino al momento del trapianto, e deve essere utilizzato entro 6 ore per ridurre al minimo la morte delle cellule da una prolungata conservazione a freddo. 2. Radioterapia – pianificazione del trattamento e l'irradiazione Sedato ratto atimici nudi (s) sono stati collocati in uno scanner MRI laboratorio nella positio inclini n con il cranio alla fine superiore (prima testa). Questo hotel a 3 tesla scanner è progettato per le scansioni di piccoli animali. Può fornire squisiti tessuti molli contrasto con alta risoluzione spaziale trasversale (assiale) immagini. La scansione focalizzato sulla regione del cranio e una serie di 22 immagini E60 T2 pesata con 0,8 mm di spessore immagine sono stati generati. Queste immagini forniscono le informazioni necessarie per identificare destra e sinistra dell'ippocampo nel cervello del ratto. Dopo la risonanza magnetica (24 ore), gli animali sono stati sedati [cocktail anestesia (ketamina, 30 mg / kg, xilazina, 2,5 mg / kg e acepromazina, 1 mg / kg)] e messo in uno scanner CT radioterapia oncologica dove un altro cross-sectional (assiale) volume dell'immagine è stata generata. Il ratto è stato messo nello stesso o in prossimità della stessa posizione utilizzata per la risonanza magnetica e l'unità CT è stato impostato per eseguire la scansione della regione cranio. Uno studio di 106 immagini CT con 0,8 mm di spessore è stata generata l'immagine che divenne la pianificazione del trattamento dei dati CT. Pianificazione del trattamentoha "> I dati delle immagini MRI e CT sono stati trasferiti al ECLIPSE (Varian Medical Systems, Palo Alto, CA) la pianificazione del trattamento tramite il software DICOM (Digital-Imaging Communications in Medicine). ECLIPSE è un software sofisticato e disponibile in commercio utilizzati in radioterapia oncologica di modellare e progettare meglio il piano di trattamento con radiazioni per il paziente. Incorpora densità di informazioni organo che viene estratto dai dati immagine del CT e utilizzati per calcolare la distribuzione della dose di radiazione all'interno del corpo. Coprire l'animale con un piccolo drappo chirurgico con solo la testa esposta. Posizionare la testa di animale saldamente all'interno del frame stereotassico (Benchmark digitale, Leica-myNeurolab) con l'inserimento di barre di orecchio nel meato uditivo esterno. Fate attenzione estrema quando scorrere la punta della barra orecchio nel condotto uditivo. Posizionare la barra degli incisivi agganciando incisivi superiori del ratto e regolando l'altezza della barra al punto di standard di riferimento, poi serrare il naso. Centrare la posizionela testa tra le sbarre orecchio con un minimo movimento laterale (± 4 mm) per raggiungere lo zero stereotassica. Il passo successivo nel processo è quello di determinare la tecnica di irradiazione da utilizzare. La terapia arco intensità modulata radioterapia (IMRT) e volumetricamente-modulata (VMAT) sotto forma di RapidArc sono 2 ad alta precisione tecniche di irradiazione che utilizzano un fascio di fotoni 6 MV per fornire una dose di radiazioni 3-6. La differenza tra queste tecniche è che IMRT rilascia una dose utilizzando diverse traiettorie statico ognuno corrispondente ad una direzione diversa, ma convergenti al volume bersaglio più adatto per volumi di destinazione estremamente piccole. RapidArc invece, rilascia una dose dinamicamente attraverso uno o più archi focalizzato sulla regione di destinazione (fig. 4). Indipendentemente dalla tecnica di recapito, informazioni sui dose target, conformità target e vincoli di dose agli organi critici devono essere inseriti nella finestrella di dosaggio ottimizzazione ECLIPSE. Tle sue informazioni con volumi d'organo è usato per adattare la distribuzione della dose, che si ottiene variando continuamente l'attenuazione del fascio durante l'irraggiamento. Una volta che un piano è stata generata, Eclipse fornisce la dose calcolata sovrapposta alla assiale, coronale e sagittale immagini (fig. 5) così come in istogramma dose-volume (DVH) formato (Fig. 6). E 'a questo punto quando il piano deve essere valutato per stabilire se è adatto per la consegna o deve essere migliorato. L'irradiazione di processo Una volta che un piano è stato approvato per la consegna, digitalmente ricostruito radiografia (RRC) le immagini sono stati generati dai dati di pianificazione del trattamento CT in Eclipse. Queste sono le immagini ortogonali ponderato sulla densità ossea per evidenziare il cranio e altri punti di riferimento ossei. In seguito, piano di trattamento e DRR vengono inviati al sistema informatico di consegna trattamento tramite DICOM. Il sistema di consegna controlla un Varian Trilogia Linear Accelerator normally utilizzato per la radioterapia degli esseri umani. L'acceleratore è dotato di 120 computer di collimatori controllato multilamellare sottile (MLC) e una qualità diagnostica a raggi X inclusi nel sistema di imaging a bordo di imaging (OBI) del sistema. Questo sistema di consegna arrivi il ECLIPSE informazioni specifiche e riconfigura i parametri nel collimatore l'acceleratore per l'erogazione della dose prevista. A questo punto il ratto è stato preparato per irradiazione, sedato e coperto con una coperta di carta per mantenerlo caldo. Dopo pochi minuti, il topo, con la sua coperta, ma con il cranio esposto, è stato posto sul tavolo di trattamento nella stessa posizione utilizzata per generare la scansione CT. Questo è un passo fondamentale, perché la precisione della posizione è direttamente correlata alla precisione nella consegna della dose. Una volta che il topo è stato posizionato correttamente sul tavolo di trattamento, una serie di ortogonale immagini a raggi X è scattata con sistema OBI della trilogia. Si tratta di immagini ad alta risoluzione che sono state successivamente fuse alla generare ECLIPSEDRR d utilizzando il software di image OBI fusione. Le immagini a raggi X e DRR sono stati abbinati digitalmente utilizzando un software che forniscono informazioni sui cambiamenti posizione della tabella che deve essere fatto per ottenere co-registrazione delle immagini (fig. 7). Dopo aver esaminato queste informazioni e verificare che gli spostamenti risultante non inavvertitamente il piombo in tutte le collisioni tra l'acceleratore e la tabella di trattamento, il computer applica i cambiamenti e la tabella di trattamento si sposta automaticamente nella posizione desiderata. A questo punto, comincia irradiazione. Per fornire una dose di 10 Gy con un 6-campo piano IMRT, il fascio-in tempo è circa 10 minuti, mentre un arco di due RapidArc dura circa 3 minuti. Dopo la consegna trattamento è completo, il ratto è stato rimosso dalla sala di trattamento e ha permesso di recuperare in una gabbia possesso continuato a una piastra elettrica. 3. Chirurgia stereotassica intra-ippocampale trapianto di cellule staminali umane Animals allevamento e preparazione chirurgica Per questo studio, abbiamo impiegato due ratti ATN vecchi mese acquisito dal National Cancer Institute (ceppo 0N01 Cr: NIH-RNU). Gli animali sono stati tenuti in gabbie sterili e conservati a temperatura e luce controllata barriera-Un ambiente con luce 12-h/12-h / ciclo scuro. I ratti sono stati forniti cibo e sterilizzati in autoclave ad libitum acqua e di cure è stata presa per prevenire l'infezione oculare da pulire gli occhi ogni settimana con unguento oculare Vetropolycin (alimentazione occidentale Medical, Arcadia, CA). Per la chirurgia stereotassica, i ratti sono stati anestetizzati con una iniezione ip di cocktail anestesia (ketamina, 30 mg / kg, xilazina, 2,5 mg / kg e acepromazina, 1 mg / kg). L'anestesia completa è stata indotta dopo 10-15 minuti e la sedazione è stata monitorata mediante riflesso palpabile (pizzico tep). Se necessario durante l'intervento, il 15-20% della dose iniziale può essere dato per mantenere l'anestesia sufficiente. Rimuovere pelliccia dalla testa utilizzando tagliatori elettrica. Circa200% di area chirurgica dovrebbe essere rasato per prevenire l'infezione da peli. Pulire parte rasata utilizzando Providone / iodio (3 volte), seguito da alcool al 70% (3 volte) prima dell'incisione. Chirurgia stereotassica Stereotassica strumenti (monitor digitale e telaio), trapano micromotore, sterilizzatore letto asciutto e controller dovrebbe essere tenuto in una cappa a flusso laminare per prevenire possibili infezioni durante la procedura di intervento nei ratti ATN. Una fase stereotassica con un tampone di riscaldamento incorporato può essere usato per tenere gli animali caldo durante l'intervento chirurgico. Abbiamo utilizzato 'Kimberly-Clark Safeskin Viola Guanti Exam Nitrile Sterile' thoughout l'intervento chirurgico. Questi guanti sono confezionati singolarmente in busta sterile (n ° cat. 55.093). Inoltre, chirurgo utilizzato a spruzzo di alcol al 70% per sterilizzare le mani durante l'intervento. Coprire l'animale con un piccolo drappo chirurgico con solo la testa esposta. Posizionare la testa di animale saldamente all'interno del frame stereotassico (Benchmark digitale, Leica-myNeurolab) inserendo orecchio bars nel meato uditivo esterno. Fate attenzione estrema quando scorrere la punta della barra orecchio nel condotto uditivo. Posizionare la barra degli incisivi agganciando incisivi superiori del ratto e regolando l'altezza della barra al punto di standard di riferimento, poi serrare il naso. Centrare la posizione della testa tra le sbarre orecchio con un minimo movimento laterale (± 4 mm) per raggiungere lo zero stereotassica. La seguente procedura di posizionamento, applicare pomata lubrificante occhio per evitare essiccazione e proteggerli da fuoriuscite di iodio possibile o alcool. Utilizzare questo unguento almeno 2 volte durante l'intervento. L'incisione cutanea mediana (2 cm) lungo cuoio capelluto con bisturi sterile, e pulire con cotone sterile con punta dell'applicatore. Evitare danni a caudale e muscoli del collo aree. Utilizzando retrattore dissezione, tenere premuto il periostio aperta e chiara dei tessuti molli con applicatore a punta di cotone imbevuto in 1% di perossido di idrogeno (made in PBS). Per arrestare l'emorragia, mantenere una pressione costante per almeno 1 kmn utilizzando cotone o garza punta dell'applicatore. Applicare movimento deciso raschiamento per pulire cranio e del movimento per la pelle tamponando fino suture craniche, bregma e lambda erano visibili. Precise coordinate stereotassica, riferita al bregma, sono stati determinati utilizzando il cervello di ratto atlante 7. Trapianto di cellule staminali è stato fatto in quattro siti diversi per ogni emisfero utilizzando le seguenti coordinate stereotassica: Anterio-posteriore (AP) 3,0 mm dal bregma, medio-laterale (ML) 1,8 millimetri dalla linea mediana, e dorso-ventrale (DV) 3,2 millimetri dalla superficie del cervello. AP, 3,6 mm, ML, 2,5 mm, DV, 3,2 millimetri AP, 4,2 mm, ML, 3,2 mm, DV, 3,2 millimetri AP, 4,2 mm, ML, 3,2 mm, DV, 3,2 millimetri Una volta che il bregma è stato identificato, tutte e tre le coordinate (AP, ML e DV) dovrebbe essere azzerato sul controller display digitale / (sulla cornice digitale stereotassica). Poi procedere a segnare i siti trapianto precisa (utilizzando le coordinate sopra) Con una penna sottile marcatore punto collegato a una porta piccola sonda sul telaio. Praticare un foro di 0,35 mm (n. 1 / 4 radica dentali, punte in metallo duro vanadio) attraverso il cranio con il pedale del piede controllato trapano micromotore (Leica-myNeurolab). Fare attenzione per evitare danni alla membrana dura. Se l'emorragia si verifica durante la perforazione, esercitare una pressione decisa con applicatore a punta di cotone. Non applicare alcol o iodio al sito trapano, in modo da causare irritazione per l'animale. I ratti hanno ricevuto bilaterali intra-ippocampale iniezioni di una sospensione di NSCs iniettato in un volume massimo di 1 ml con un 5 microlitri microsiringa Hamilton (30 gauge). Il numero preciso di cellule all'interno di questo volume può variare in base alle specifiche sperimentale. Per fare questo, la microsiringa è stato collegato a una porta piccola sonda sul telaio stereotassico. Inserire con attenzione la punta dell'ago nel cranio fino a raggiungere la superficie del cervello (meningi per esempio). A questo punto, il DV coordinamentote dovrebbe essere azzerato sul controller display digitale /, poi inserire delicatamente l'ago alla profondità desiderata (DV, 3,2 mm). Attendere 1 minuto prima di iniziare qualsiasi iniezione di cellule. Iniettare il volume 0,25 microlitri / min (lento rilascio) utilizzando un timer. Una volta che un totale di 1 ml viene iniettata, aspettare 8 minuti prima che l'ago ritraendo dal sito trapianto. Trascorso questo tempo, lentamente ritirare l'ago dal sito di trapianto (0,5 mm / min) per prevenire il reflusso capillare dei contenuti iniezione indietro attraverso il percorso dell'ago. Seguire i passaggi 3.2 (JK) per i siti trapianto restante (4 per ogni emisfero). Rimuovere il riavvolgitore pelle dal cranio e l'uso delle pinzette smussato per tirare dolcemente la pelle di nuovo ritrattato e applicare 4-5 clip inossidabile sterile utilizzando Autoclips sutura chirurgica applicatore (Leica-myNeurolab). Dopo aver rimosso l'animale dal telaio, iniettare con analgesici (Buprenorphin, 0,1 mg / kg, sc, ogni 12h) e soluzione di Ringer lattato (5 mL/250 ratto adulto g, sc). Posizionare il nuovo animale nella sua gabbia che dovrebbe essere tenuto su una piastra elettrica. Monitorare l'animale fino a che non prende coscienza prima di tornare al suo locale di permanenza. Mettere alcuni inumidito pellet (animale chow) e transgel in un piatto a parte Petri in ogni gabbia animale. In alternativa, DietGel Recovery (ClearH 2 O, Portland, ME) possono essere utilizzati come fonte di acqua e nutrienti. Monitorare gli animali durante il loro tempo di recupero e di applicare l'analgesia (buprenorfina 0,02 mg / kg (ogni 12 ore per 2 giorni). Verificare la presenza di segni di dolore, angoscia, arrossamento o infezioni del sito chirurgico. Applicare Providone / iodio o pomate Neosporin una volta al giorno (fino a 2 -3 gg) per prevenire possibili infezioni. In presenza di segni di infezione, dolore o disagio persiste dopo il trattamento analgesico o un antibiotico entro le 12 ore di intervento chirurgico, consultare il veterinario o la cura personale animale per ulteriore assistenza. 4. Rappresentante dei risultati: iles/ftp_upload/3107/3107fig1.jpg "/> Figura 1. Rappresentazione schematica del nostro piano sperimentale. Figura 2. Fusion di CT (anatomia ossea) e RM (tessuti molli) le immagini all'interno del software ECLIPSE. Corrispondenza delle sezioni assiale, coronale e sagittale consentire la co-Registro delle caratteristiche anatomiche critiche del cervello di ratto derivati da ogni modalità di imaging. Figura 3. Sagomato regioni dell'ippocampo del cervello. In seguito alla fusione di immagini, ippocampo e il cervello ad esclusione dell'ippocampo sono identificati e sagomato assialmente definire specifiche regioni volumetrico per questi organi. Queste regioni di fornire informazioni anatomiche e volume necessario per regolare la distribuzione della dose al bersaglio desiderato (s). ure 4 "src =" / files/ftp_upload/3107/3107fig4.jpg "/> Figura 4. Alta opzioni di irradiazione di precisione utilizzando una terapia ad intensità modulata (IMRT) o volumetricamente modulata terapia arco (VMAT) sotto forma di RapidArc. Queste tecniche offrono 6 fasci di fotoni MV sia come molteplici traiettorie statici che possono convergere su volumi bersaglio molto piccolo (IMRT), o in modo dinamico come uno o più archi focalizzato sulla regione di destinazione (RapidArc). Figura 5. Dosi ECLIPSE calcolato sovrapposti alle immagini assiali. Le dosi indicate sono per i piani di irraggiamento a singolo o doppio trattamento dell'ippocampo. Figura 6. ECLIPSE calcolato dose-volume istogramma. Dati contrasti la percentuale di irradiati rispetto al non-irradiati volume dell'ippocampo sotto la hippoc singolopiano di trattamento Ampus mostrato in fig. 5. Figura 7. Posizionamento ratto immagine guidato per la radioterapia. Ortogonali digitalmente ricostruito radiografia (RRC) le immagini generate dai dati di pianificazione del trattamento CT in Eclipse si fondono a ortogonali immagini a raggi X del topo sul tavolo trattamento scattate con la Trilogia di bordo per immagini (OBI) del sistema. Il DRR sono ponderati sulla densità ossea che evidenzia il cranio e gli altri punti di riferimento ossei che facilitano la co-registrazione con le immagini OBI. Corrispondenza di questi insiemi fornire un trattamento turni posizione della tabella che deve essere fatto per ottenere la co-registrazione del CT e immagini a raggi X. Figura 8. Posizione NSCs trapiantate dopo la chirurgia stereotassica. Ad 1 mese post-trapianto, gli animali sono stati perfusi, i cervelli sono stati sectioned e colorati con BrdU (per rilevare NSCs trapiantato) e colorati con ematossilina contatore. La pista ago (Nt, linea rossa), indica la traiettoria di iniezione che deposita NSCs al trapianto-release del sito (Tr), appena sotto il corpo calloso (CC) e sopra il CA1. NSC trapiantato ha mostrato ampia migrazione da Tr in tutto l'ippocampo host (giro dentato, DG, ilo dentato, DH, CA1 e CA3 sottocampi; x4 ingrandimento). Scala a barre, 200 micron.
