Bizim deneysel planı Şekil 1'de şematik diyagramı. 1. Transplantasyon için insan sinir kök hücrelerinin (NSC'lerde) Büyüme ve hazırlık EnStem-A hücre hattı (EMD Millipore), bu çalışmada kullanılmıştır. NSC'lerde rutin multipotent işaretleri nestin ve Sox2 ifade düzeyleri, yüksek ve düşük seviyeli bir ifade için birden fazla nöronal fenotipleri ayırt etmek ve sonra normal bir karyotip korumak için yeteneği ile birlikte pluripotent marker Ekim-4, üretici tarafından onaylanmıştır. birden fazla geçit. Büyüme koşulları altında, bu NSC'lerde Sox2 ve nestin bol ifadesi görüntülenir ve daha önce 1 açıklandığı gibi, ayırt etmek için kendi yeteneğini muhafaza. NSC'lerde poli-L-ornitin (20 mg / ml) ve laminin (5 mg / ml) kaplı doku kültürü tedavi şişeler yetişen. Hücreler, L-glutamin (2 mM) ile desteklenmiş sinir genişleme orta (Millipore) ve temel fibroblast büyümebüyüme faktörü (bFGF; 20 ng / ml). NSC'lerde yapışmış mono tabakaları ayrışma ajanı olarak accutase 1 ile her geçen gün pasajlandı (1:2). Transplantasyon çalışmaları için NSC'lerde altında 10 pasajlar kullanılmıştır. NSC'lerde nakli için önce üç gün boyunca 4 mcM BrdU büyüme ortamı tamamlayan 5-bromo-2'-dezoksiuridin (BrdU) ile etiketli. BrdU etiketleme indeksi (yani BrdU pozitif hücrelerin yüzdesi) doğrulamak için, hücre oda slaytlar üzerinde kaplama ve BrdU tespiti için standart immünositokimyasal yaklaşımlar kullanılarak işlenen edildi. Nakli için kullandığı hücreler rutin olarak 90% 2 aşan endeksleri etiketleme sergilerler . Alternatif olarak, insan özel nükleer antijen işaretleyici (HuNu) 2 nakledilen insan kök hücreleri kullanılarak tespit edildi. Accutase ve nöral genişleme medya nakli günü 37 ° C su banyosunda önceden ısınmış edildi. Hücreleri (kuluçka orta yerleştirildi 10 mcM içeren nöral genişleme medyaY-27.632) bir saat. Y-27.632 (ROCK inhibitörü, EMD-Calbiochem) NSC'lerde transplantasyon sonrası hayatta kalma artırmak için kullanılır oldu. 5 dakika, bir saat sonra, kuluçka medya kaldırıldı ve hücreler accutase ile tedavi edildi. Bu kısa bir tedaviden sonra, accutase nötralize ve 70 mcM hücre süzgecinden hücrelerin zorlanma sinir genişleme medya eşit miktarda ekleyebilirsiniz. Haemocytometer ile hücre sayımı ve enjeksiyon orta mikrolitrelik başına 1.0 x 10 5 canlı NSC'lerde (nöral genişleme medya Y-27.632, 40 ng / ml bFGF, 20 ng / ml 'BDNF 10 mcM içeren) hazırlamak. Hücreler nöral genişleme medya saklanır (1.5 'de açıklandığı gibi) ve nakli zamana kadar buz üzerinde tutulur ve uzun süreli soğuk hava depoları hücre ölümünü en aza indirmek için 6 saat içinde kullanılmalıdır. 2. Radyoterapi tedavi planlama ve ışınlama Sedatize atimik çıplak sıçan (ler) eğilimli positio bir laboratuvar MRI tarayıcısı yerleştirildi n üstün sonunda kafatası ile (ilk başkanı). Bu 3 tesla tarayıcı küçük hayvan taramalar için tasarlanmıştır. Bu, yüksek uzaysal çözünürlüğü kesitsel (eksenel) görüntüleri ile zarif, yumuşak doku kontrast sağlayabilir. Kafatası bölgesi, 0,8 mm görüntü kalınlığında ve 22 T2 E60 ağırlıklı görüntülerde bir dizi odaklı tarama oluşturulmuştur. Bu görüntüler, sıçan beyninin içinde sağ ve sol hippocampi tespit için gerekli bilgileri sağlar. MRI tarama (24), hayvanlar sedatize edildi [] anestezi (ketamin 30 mg / kg, ksilizin, 2.5 mg / kg ve acepromazine, 1 mg / kg) kokteyl takip etmek ve başka bir kesitsel bir radyasyon onkolojisi CT tarayıcı yerleştirilir (eksenel) görüntü hacmi oluşturulmuştur. Sıçan yerleştirildi MRI tarama için kullanılan ve kafatası bölgeyi taramak için BT ünitesi kuruldu olarak aynı konumda aynı veya yakın. 106 BT görüntüleri üzerinde yapılan bir çalışmada, 0.8 mm görüntü kalınlığı ile CT tedavi planlama verileri oldu oluşturuldu. Tedavi Planlamasıha "> MRI ve CT görüntü verilerini DICOM (Digital Imaging and Communications in Medicine) üzerinden ECLIPSE (Varian Medical Systems, Palo Alto, CA) tedavi planlama yazılımı transfer edildi. ECLIPSE, radyasyon onkolojisi, bir hasta için en iyi radyasyon tedavi planı model ve tasarım için kullanılan bir sofistike ve piyasada bulunan bir yazılım. CT görüntü verilerini çıkarılan ve vücut içinde radyasyon doz dağılımı hesaplamak için kullanılan organ yoğunluk bilgileri içermektedir. Maruz kalan sadece kafa ile küçük bir cerrahi örtü kullanarak hayvan örtün. Dış kulak yolunun kulak bar takarak sıkıca stereotaksik frame (Benchmark Dijital Leica-myNeurolab) içinde hayvan kafası yerleştirin. Kulak kanalı içine kulak çubuğunun ucunu kaydırarak çok dikkat edin. Sıçan üst kesici dişler çengel ve standart referans noktası çubuğunun yüksekliğini ayarlama kesici çubuğu yerleştirin, sonra burun kelepçe sıkın. Merkezi konumunustereotaksik sıfır elde etmek için minimal lateral hareketi (± 4 mm) ile kulak çubukları arasındaki kafa. Sürecin bir sonraki adım, kullanılacak ışınlama tekniği tespit etmektir. RapidArc şeklinde yoğunluk ayarlı radyasyon terapisi (IMRT) ve hacimsel olarak modüle ark terapisi (VMAT) bir radyasyon dozu 3-6 sunmak için 6 MV foton demeti 2 yüksek hassasiyetli ışınlama teknikleri. Bu teknikler arasında fark IMRT birkaç statik yörüngeleri farklı bir yöne her ilgili değil, son derece küçük hedef miktarlar için daha uygun hedef hacim yakınsak bir doz sağlar. RapidArc Öte yandan, hedef bölge (Şekil 4) odaklanmış bir veya daha fazla yay boyunca dinamik bir doz sağlar. Ne olursa olsun teslim tekniği, hedef doz hakkında bilgi, hedef uygunluğu ve kritik organlara doz kısıtlamaları ECLIPSE doz optimizasyon penceresinde girilmesi gerekir. Torgan hacimleri ile birlikte kendi bilgi, ışınlama sırasında kiriş zayıflama sürekli değişen elde edilir terzi doz dağılımı için kullanılır. Bir planı oluşturulmuş, ECLIPSE aksiyel, koronal ve sagital görüntüler (Şekil 5) ve doz-hacim histogramı (DVH) formatında (Şekil 6) olarak üst üste hesaplanan doz sağlar. Bu planı, teslimat ya da iyileştirilmesi gerekmektedir uygun olup olmadığını belirlemek için değerlendirilmesi gereken zaman bu noktada. Işınlama Süreci Bir plan ECLIPSE CT tedavi planlama verilerini dijital olarak yeniden inşa grafisi (DYO) görüntüleri oluşturulur, teslimat için kabul edildi. Bunlar kafatası ve kemik simge vurgulamak için kemik yoğunluğu ağırlıklı dik görüntüleri. Bundan sonra, tedavi planı ve DRRs DICOM yoluyla tedavi teslim bilgisayar sistemine gönderilir. Dağıtım sistemi, Varian Trilogy Lineer Hızlandırıcı n kontrolormally insanlar radyoterapi için kullanılır. Hızlandırıcı 120 bilgisayar kontrollü ince multileaf kolimatör (MLC) ve on-board görüntüleme (OBI) sistemi içinde yer alan bir tanı kaliteli x-ray görüntüleme sistemi ile donatılmıştır. Bu dağıtım sistemi yüklenenler ECLIPSE özgü bilgiler ve planlı bir doz teslim için hızlandırıcı kolimatör parametrelerini yeniden yapılandırır. Bu noktada, sıçan, ışınlanması için hazırlanan sedasyon ve sıcak tutmak için bir kağıt battaniye ile örtülü idi. Birkaç dakika sonra, sıçan, battaniye ile ancak maruz kalan kafatası CT taraması oluşturmak için kullanılan aynı pozisyonda tedavi masaya kondu. Bu pozisyon doğruluğu doz teslim doğruluk doğrudan ilişkili olması nedeniyle kritik bir adımdır. Sıçan tedavi masanın üzerine düzgün bir şekilde yerleştirildi sonra dik X-ray görüntüleri bir dizi Trilogy OBI sistemi kullanılarak alınır. Bunlar sonradan ECLIPSE oluşturmak için erimiş olan yüksek çözünürlüklü görüntüleriOBI görüntü birleştirme yazılımı kullanarak d DRRs. X-ray görüntüleri ve DRRs dijital görüntüleri co-kayıt (Şekil 7) ulaşmak için yapılmalıdır masa pozisyonu vardiya hakkında bilgi sağlayan yazılım ile uyumlu idi. Bu bilgilerin gözden geçirilmesi ve ortaya çıkan kaymalar yanlışlıkla herhangi bir hızlandırıcı ve tedavi tablo arasında çarpışmalar içine yol açmaz olduğunu doğruladıktan sonra, bilgisayar vardiya geçerlidir ve tedavi tablo istenilen konuma otomatik olarak hareket eder. Bu noktada, radyasyon başlar. Iki ark RapidArc ~ 3 dakika sürer 6 alanında IMRT planı ile 10 Gy doz teslim etmek, kiriş-zaman yaklaşık 10 dakika sürmektedir. Tedavi teslim işlemi tamamlandıktan sonra, sıçan tedavi odası kaldırılır ve bir ısıtma pedi üzerinde tutulan bir holding kafese kurtarmak için izin. 3. , Insan kök hücre içi-hipokampal nakli için stereotaksik cerrahi Animals hayvancılık ve cerrahi hazırlığı Bu çalışma için, Ulusal Kanser Enstitüsü (NIH-rnu suşu 0N01 Cr) elde edilen iki aylık ATN sıçanlarda istihdam. Hayvanlar steril kafeslerde tutulan ve bir sıcaklık ve 12-h/12-h ışık / karanlık döngüsü ile ışık kontrollü bariyer bir ortamda tutuldu. Sıçanlar otoklavlanmış yiyecek ve su ad libitum verilmiştir ve bakım, Vetropolycin göz merhemi (Batı Tıbbi Malzeme, Arcadia, CA) ile her hafta gözler temizlik göz enfeksiyonu önlemek için alınmıştır. Stereotaksik cerrahi için, sıçanlarda, anestezi kokteyl bir ip enjeksiyon (ketamin 30 mg / kg, ksilizin, 2.5 mg / kg ve acepromazine, 1 mg / kg) ile anestezi edildi. Komple anestezi ve sedasyon 10-15 dakika palpabl refleksi (ayak tutam) ile izlenen sonra sağlandı. Ameliyat sırasında gerekli görüldüğü takdirde, orijinal dozun% 15-20 oranında, yeterli anestezi korumak için verilebilir. Elektrik kesme makineleri kullanarak baş kürk çıkarın. Yaklaşık olarakCerrahi alanında% 200 kıllar enfeksiyonu önlemek için traş edilmelidir. Temizlik traş parçası providone / kesi önce% 70 alkol (3 kez) tarafından takip iyot (3 kez) kullanarak. Stereotaksik cerrahi Stereotaksik aletleri (dijital monitör ve çerçeve), mikromotor matkap, kuru yatak sterilizatör ve denetleyicileri, ATN sıçanlarda cerrahi işlem sırasında olası bir enfeksiyonu önlemek için bir Laminer akış kaputu tutulmalıdır. Gömülü bir ısıtma pedi ile stereotaksik aşamada, ameliyat sırasında hayvanların sıcak tutmak için kullanılabilir. Biz cerrahi thoughout Kimberly-Clark Safeskin Mor Nitril Steril Sınav Eldiven 'kullandı. Bu eldivenler ayrı ayrı (Kat. no. 55.093) steril torba içinde paketlenir. Buna ek olarak, cerrahın ameliyat sırasında ellerini sterilize etmek için% 70 alkol sprey kullandı. Maruz kalan sadece kafa ile küçük bir cerrahi örtü kullanarak hayvan örtün. Hayvan kafa pozisyonu kulak ba takarak sıkıca stereotaksik çerçeve içinde (Benchmark Dijital Leica myNeurolab)dış kulak yolunun içine rs. Kulak kanalı içine kulak çubuğunun ucunu kaydırarak çok dikkat edin. Sıçan üst kesici dişler çengel ve standart referans noktası çubuğunun yüksekliğini ayarlama kesici çubuğu yerleştirin, sonra burun kelepçe sıkın. Merkezi stereotaksik sıfır elde etmek için minimal lateral hareketi (± 4 mm) ile kulak çubukları arasında baş pozisyonu. Bu konumlandırma adımları izleyerek, kurumasını önlemek ve onları korumak için mümkün olan iyot ya da alkol dökülen göz merhemi yağlama uygulanır. Ameliyat sırasında bu merhem en az 2 kez kullanın. Steril neşter kullanılarak kafa derisi boyunca orta hat cilt insizyonu (2 cm) ve steril pamuk kullanarak temiz bir aplikatör uçlu. Kuyruk ve boyun kasları alanlarda zarar görmesini önleyin. Diseksiyon retraktörü kullanarak, pamuk uçlu bir aplikatör kullanarak periost açık ve net bir yumuşak doku tutun,% 1 hidrojen peroksit (PBS içinde yapılan) batırılmış. Kanamayı durdurmak için, en az 1 mi sağlam basıncı korumakn pamuk uçlu bir aplikatör veya gazlı bez. Kafatası sütür, bregma ve lambda görülüyordu kadar, kafatası ve cilt için hareket dabbing temizlemek için firma kazıma hareketi uygulayın. Bregma referanslı Hassas stereotaksik koordinatları, sıçan beyin atlası 7 kullanılarak belirlenmiştir. Kök hücre nakli, aşağıdaki stereotaksik koordinatları kullanarak her yarımkürede dört farklı sitelerde yapıldı: Beyin yüzeyinden bregma gelen posterio-posterior (AP) 3.0 mm, orta hattan medio-lateral (ML) 1.8mm ve dorso-ventral (DV) 3.2mm. AP, 3.6 mm, ML, 2,5 mm; DV, 3.2 mm AP, 4,2 mm, ML, 3.2 mm; DV, 3.2mm AP, 4,2 mm, ML, 3.2 mm; DV, 3.2mm Bregma tespit edildikten sonra, üç koordinatları (AP, ML ve DV) dijital ekran / denetleyici (dijital stereotaksik çerçeve) zeroed olmalıdır. Sonra Yukarıda koordinatları kullanarak hassas nakli siteleri (işareti geçin) Ince bir nokta marker kalem ile çerçeve üzerinde küçük bir prob tutucu bağlı. Ayak pedalı kontrollü mikromotor matkap (Leica-myNeurolab) kullanılarak kafatası yoluyla (no. 1 / 4 diş çapak, karbür vanadyum matkap) 0.35mm bir delik delin. Dura zarı zarar görmesini önlemek için özen gösterin. Sondaj sırasında kanama oluşursa, pamuk uçlu bir aplikatör kullanarak sağlam bir basınç uygulayın. Bu hayvan tahrişe neden olacağı için, matkap yerinde alkol veya iyot sürmeyin. Sıçanlar bilateral hipokampal içi enjeksiyonları 1 mcL maksimum hacmi 5 mcL Hamilton mikroenjektör (30 gauge) kullanılarak enjekte NSC'lerde askıya aldı. Bu hacim içindeki hücrelerin tam sayısını deneysel bilgilere göre değişecektir. Bunu başarmak için, mikroenjektör stereotaksik çerçeve üzerinde küçük bir prob tutucu bağlanmıştır. Beynin yüzeyine ulaşan (yani meninksler) kafatasında iğne ucu kadar dikkatlice yerleştirin. Bu noktada, DV koordinasyonte dijital ekran / denetleyici zeroed olmalı, sonra yavaşça istenilen derinliğe (DV, 3,2 mm) iğne eklemek. Herhangi bir hücre enjeksiyonu başlamadan önce 1 dakika bekleyin. 0.25 mcL hacim / dk (yavaş salınımlı) bir zamanlayıcı kullanılarak enjekte edilir. 1 mcL toplam enjekte edildikten sonra, geri çekilmeden iğne önce, transplantasyon sitesinden 8 dk bekleyin. Bu süreden sonra, yavaş yavaş enjeksiyon içeriğini kılcal reflü iğne parçası ile geri önlemek için transplantasyon sitesi (0.5 mm / dak) iğne geri. Kalan nakli siteleri (yarımküre başına 4) için adımları 3.2 (JK) izleyin. Kafatası cilt retraktörü çıkarın ve geri çekilmektedir cildi hafifçe çekin ve 4-5 steril paslanmaz klipleri Autoclips cerrahi sütür uygulayıcısı (Leica-myNeurolab) kullanarak uygulamak için künt cımbız kullanın. Çerçeve hayvan çıkardıktan sonra, ağrı kesici enjekte (Buprenorphin, 0.1 mg / kg, sc, her 12 saat) ve (mL/250 g yetişkin sıçan, sc 5) Zil çözümü Laktatlı. Bir ısıtma pedi üzerinde tutulmalıdır, kafeste hayvan geri yerleştirin. Kendi tutarak odaya dönmeden önce bilinçli hale gelinceye kadar hayvan izleyin. Bazıları her bir hayvan kafesi ayrı bir petri pelet (hayvan yemi) ve transgel nemlendirilmiş yerleştirin. Alternatif olarak, DietGel Kurtarma (ClearH 2 O, Portland, ME), su ve besin kaynağı olarak kullanılabilir . Monitör ve onların iyileşme süresi sırasında hayvanların acı, sıkıntı, kızarıklık veya cerrahi sitede enfeksiyon belirtileri olup olmadığını kontrol edin analjezi (buprenorfin 0.02 mg / kg (2 gün boyunca her 12 saat). Geçerlidir. Providone / iyot veya neosporin merhemi günde bir kez uygulayın (2 kadar herhangi bir enfeksiyon, ağrı veya sıkıntı belirtisi, ameliyattan 12 saat içinde ağrı kesici veya antibiyotik tedavisi sonrasında devam ederse, olası bir enfeksiyonu önlemek için -3 gün), veteriner hekim veya hayvan bakım personeli daha fazla yardım için danışın. 4. Temsilcisi sonuçları: iles/ftp_upload/3107/3107fig1.jpg "/> Şekil 1 bizim deneysel planı şematik. Şekil 2: Fusion CT (kemik anatomi) ve MRG (yumuşak doku) ECLIPSE yazılım içinde görüntüler. , Aksiyel, koronal ve sagital kesitler Eşleştirme, her bir görüntüleme yöntemidir türetilmiş sıçan beyin kritik anatomik özellikleri eş kayıt için izin verir. Şekil 3 beyin hipokampal bölgelerde Konturlu. Görüntü füzyon sonra, hippocampi hariç hippocampi ve beyin tespit ve bu organlar için belirli hacimsel bölgelerinde eksenel tanımlayan konturlu. Bu bölgeler doz dağılımı istenen hedef (ler) ayarlamak için gerekli anatomik ve hacim bilgileri sağlar. ure 4 "src =" / files/ftp_upload/3107/3107fig4.jpg "/> Şekil 4 RapidArc şeklinde yoğunluk ayarlı radyasyon terapisi (IMRT) veya hacimsel modüle ark terapisi (VMAT) kullanarak yüksek hassasiyetli ışınlama seçenekleri. Bu teknikler, 6 MV foton olarak çok küçük bir hedef hacimleri yakınsama birden fazla statik yörüngeleri kirişler teslim (IMRT), ya da dinamik olarak hedef bölge (RapidArc) odaklanmış bir veya daha fazla yay gibi. Şekil 5 eksenel görüntüleri üst üste ECLIPSE hesaplanan dozlarda. Tek veya çift hippocampi ışınlama tedavi planları için gösterilen dozlar. Şekil 6 ECLIPSE doz-hacim histogramı hesaplanır. Veri tek hippoc altında olmayan ışınlanmış hipokampal hacim karşı ışınlanmış yüzde tezatampus tedavi planı Şekil. 5. Şekil 7: Görüntü kılavuzluğunda radyoterapi sıçan konumlandırma . ECLIPSE CT tedavi planlaması veri Ortogonal dijital olarak yeniden inşa grafisi (DYO) görüntüleri sıçan Trilogy on-board görüntüleme (OBI) sistemi ile çekilen tedavi masaya dik x-ray görüntüler kaynaşmıştır. DRRs, kafatası ve OBI görüntüleri ile birlikte kaydı kolaylaştıran diğer kemikli yerlerinden vurgulamaktadır kemik yoğunluğu ağırlıklı. Bu ayarlar Eşleştirme BT ve x-ray görüntüler eş-kayıt ulaşmak için yapılmalıdır tedavi masa pozisyonu vardiya sağlar. Şekil 8 stereotaksik cerrahi sonrası nakledilen NSC'lerde yeri. Transplantasyon sonrası 1 aylık, hayvanlar perfüze edildi, beyinleri sectioned ve BrdU (nakledilen NSC'lerde saptamak için) ve hematoksilen ile karşı boyanmış ile boyandı. Iğne parça (Nt, kırmızı çizgi), korpus kallosum (CC) hemen altında ve transplant-release sitesi (Tr) NSC'lerde yatırılan enjeksiyon yörünge CA1 yukarıda gösterir. Nakledilen NSC'lerde Tr ana hipokampus (dentat hilus, DH; CA1 ve CA3 alt alanlar; büyütme x4 dentat girus, DG) boyunca yoğun göç gösterdi. Ölçek bar, 200 mm.
