Automatisé d'interaction hydrophobe Chromatographie sur colonne de sélection pour l'utilisation dans la purification des protéines

1. Tampon et préparation des échantillons Note technique: Tous les tampons doivent être réfrigérés et chaque étape de ce protocole doit être effectué sur la glace ou à 4 ° C, sauf indication contraire. Le basse température est essentiel pour empêcher la dégradation de la protéine à purifier et d'assurer des conditions de fonctionnement optimales. Médias HIC peut produire des résultats différents de séparation si elle est exploitée à la température ambiante, et le système de chromatographie doit être utilisé dans un coffret de 4 ° C d'ambiance froide ou froide. Préparer 500 ml de les tampons suivants: 200 mM NaH 2 PO 4 (Tampon A1), 200 mM de Na 2 HPO 4, (tampon A2), et 4,8 M (NH 4) 2 SO 4 (B2 tampon). L'eau déminéralisée (B1 Buffer) seront également utilisés. Dégazer la mémoire tampon afin d'assurer des conditions de fonctionnement optimales chromatographiques. Le système de maximisation se mélangent Tampons A1 et A2 pour générer un tampon faible teneur en sel de phosphate d'élution, et il se mélangera B1 et B2 Tamponspour générer le tampon en sel d'ammonium de sulfate de début (2,4 M (NH 4) 2 SO 4). Préparer 20 ml d'échantillon à être chargé en mélangeant 10 ml de lysat cellulaire contenant la protéine à purifier avec 10 ml de tampon B2. La concentration d'ammonium de sulfate finale de la solution d'échantillon de lysat cellulaire doit être d'environ 2,4 M (NH 4) 2 SO 4, rendant peu près équivalente à la mémoire tampon de début. Lysat cellulaire peut être préparé par remise en suspension du culot cellulaire bactérienne dans un tampon TE (Tris 10 mM EDTA 1 mM, pH 8,0) suivi par sonication ou par addition de 1 mg / ml de lysozyme et centrifugation à 3700 xg pendant 10 minutes. Filtrer le mélange lysat-tampon à travers une faible teneur en protéines se liant 0,45 um seringue filtre pour éliminer les particules de la solution. Maintenir l'échantillon sur la glace jusqu'à ce qu'il soit prêt à être chargé dans le système. 2. Installation physique et de la plomberie de DuoFlow Système de chromatographie Assurez-vous tout pouvoir appareil et les raccordements de communication sont faits. Les dispositifs devraient être visibles dans le DuoFlow biologique chromatographie fenêtre du logiciel de commande manuelle. Un résumé des périphériques sont répertoriés dans le tableau 1. Une illustration du système et le schéma de plomberie est à la figure 2. Fixez les connexions électriques pour les vannes à des orifices de la pompe et le système Maximizer postes de travail tels que la numérotation du port suit une séquence logique. Étiquetez chaque vanne avec son numéro de port respectif pour référence future. Le poste de travail de la pompe et le système Maximizer servir les liaisons de communication principales entre l'ordinateur / contrôleur et le système de chromatographie. Vannes sera automatiquement reconnu et affiché dans le logiciel lorsqu'il est connecté à chaque périphérique. Note technique: Pendant le fonctionnement du système de chromatographie en mode manuel, les soupapes sont commandées indépendamment. Prendre soin pour vérifier que le trajet d'écoulement souhaité est configuré, en particulier lorsque les vannes de commutation, avant d'initier chamoisdébit er. Plonger le tube dans Téflon Tampons A1, A2, B1 et B2. Assurez-vous de volumes adéquats de tampon sont disponibles pour le protocole entier et que le tube va continuer de rester en plongée. Préparation de 500 ml de tampons A1, A2 et B2 et 1 L de tampon B1 sera suffisant. Plumb échantillon de chargement de soupape et boucle d'échantillonnage dynamique comme l'illustre la figure 2 et selon les instructions du fabricant. Connectez la boucle d'échantillonnage à l'entrée de la vanne de l'échantillon (position 3) en utilisant la plus petite longueur de tube possible. Cela permettrait de minimiser la dilution des échantillons au cours du processus de charge de l'échantillon. Réduire la longueur du tube entre l'échantillon, la pompe de chargement des échantillons, et entrée de la vanne échantillon de chargement (Position 2). Cela réduira la quantité d'échantillon nécessaire pour charger la boucle d'échantillonnage. Préparez 8 paires de taille identique de 1/16 "tube PEEK OD, avec chaque paire reliés entre eux par un syndicat 1/4-28 femelle female-to-1/4-28. Branchez les paires de positions 1-8 de la deuxième colonne vannes de sélection. l'Union 7est connecté en ligne à des postes de la colonne de sélection de vannes 2-8 sera plus tard remplacé par des colonnes de chromatographie à tester. Le syndicat en ligne liée à la position 1 sera maintenue comme une voie de contournement colonne de chromatographie. Note technique: Veiller chaque paire de tube est relié à la même position sur les deux vannes de sélection de colonne. Tournez à la fois sur l'UV 4-longueur d'onde / Détecteur de Vis (Quadtec) de la lampe et longueur d'onde fixe 280 nm lampe UV détecteur. Les longueurs d'onde à mesurer par le Quadtec pour ce protocole comprennent 214 nm, 280 nm, et 397 nm. Mesure 280 nm à la fois avec le détecteur UV longueur d'onde fixe et Quadtec fournit une redondance du système et assure la validité des données. Confirmez tous les détecteurs sont calibrés conformément aux instructions du fabricant. Le régulateur de contre-pression qui est nécessaire pour réduire l'accumulation de bulles d'air dans les détecteurs et doit être installé en aval des détecteurs mais en amont de l'écran du pH. Le système présenté ici comprend deux fractiocollectionneurs n, qui offre une commodité importante pour l'analyse éluat après la course. Fixer les collecteurs de fractions, les flux de séparateur de soupapes, et le contrôleur de séparation, comme illustré dans la figure 2. Le collecteur de fraction relié à la position 1 de la vanne de séparation permettra de recueillir 900 fractions d'éluat ul dans 12 tubes de culture ml, tandis que le collecteur de fraction relié à la position 2 permettra de recueillir 100 fractions d'éluat ul dans 96 plaques de microtitration ainsi. Le collecteur de fraction la position 2, clapet de répartition, et le répartiteur de commande sont exploités hors du poste de travail chromatographie. Le contrôleur diviseur est contenu dans une pompe à Bio-Rad Econo dégradé, mais la composante de la pompe de l'appareil n'est pas utilisé. Un "Split%" réglage de l'option sera affichée sur la pompe à gradient Econo lorsque la soupape de diviseur est connecté. % Split Set à 10. Le collecteur de fraction Position 1 permettra de recueillir 90% de l'éluat (900 pl / fraction), et le collecteur de fraction Position 2 permettra de recueillir10% (100 pi / fraction). Les collecteurs de fractions avancera en synchronisme permettant numéros fraction de deux collecteurs de correspondre à l'autre. Remplacer la tête fraction norme collecteur goutte sur le collecteur de fractions Position 2 avec une tête goutte de microplaques. La tête goutte microplaque a une ouverture plus petite, ce qui permet la collecte des tailles baisse de 50% plus petites (soit 25 pi au lieu de la norme 50 pi) et est particulièrement bénéfique lors de la collecte ≤ 500 fractions ul. Utilisation du panneau de commande à l'écran, réglez le collecteur de fraction Position 2 à recueillir des fractions en plaques à 96 puits et avance à une vitesse de 1 échantillon / minute. Le contrôleur de diviseur et collecteur de fractions position 2 est lancée manuellement immédiatement après le début de la course première chromatographie. Rincer le collecteur de fractions position 2 et la tête goutte de microplaques avec B1 tampon. 3. Lignes système d'amorçage, méthode Run Programmation et EquilibratIng colonnes HIC Avec des lignes d'entrée du système Maximizer immergé dans Tampons dégazés A1, A2, B1, B2, et les premiers du poste de travail pompes, rincer boucle d'échantillonnage, et rincer le système de chromatographie par les instructions du fabricant. Étape d'amorçage complet avec tous les 4 entrées Maximizer System (A1, A2, B1, et B2) afin d'éliminer les bulles d'air restantes. Préparer le système nécessite manoeuvre manuelle de la commande de système via le logiciel BioLogic. Confirmer le bon positionnement de la vanne de charge de l'échantillon et vannes de sélection de colonne avant de commencer flux de tampon. Préparez-vous à lancer un manuel de 1 ml / minute de débit de tampon d'élution (0% B) à travers le système, tel que décrit dans les étapes 3,4-3,5. Dans la fenêtre Installation du logiciel du programme BioLogic, sélectionnez "Utiliser buffer blending» et «un tampon phosphate avec du sulfate d'ammonium". Confirmez Tampons A1, A2, B1, B2 et répertorié dans la fenêtre de configuration correspondent à ceux qui sont prêts. Manuellement régler le débit à 1 ml / minute de tampon d'élution(B 0%). Observez la contre-pression, la conductivité, tracés UV, et le pH restent cohérents et dans les limites normales de fonctionnement. Anomalies indiquent l'air ou de blocage colonne qui doit être adressée avant de procéder. Rincer toutes les 8 lignes de sélection de colonne avec 5 ml de tampon d'élution. Pour ce faire, d'abord en arrêtant l'écoulement, la mise en deux vannes de sélection de colonne à la position 2, et la reprise du 1 ml / minute de débit, 0% B. Répétez l'opération pour les lignes de sélection de colonnes en positions 3-8. Connectez-1 colonnes ml HiTrap HIC à des postes de 2-8 des vannes de sélection de colonne. Effectuer les étapes 3.8-3.13 avec une colonne à la fois. Prenez note de la colonne qui HIC est placé dans laquelle position de la vanne de sélection. Un résumé des médias colonne HIC caractéristiques énumérées dans le Tableau 2. La connexion physique des colonnes de GE Healthcare HiTrap au système de Bio-Rad DuoFlow exige une série de raccords en utilisant 1/4-28, M6, et les raccords Luer. Retirer l'union qui relie les 2 postes vannes de sélection de colonne. Unelign le Bio-Rad et GE Healthcare raccords comme illustré à la figure 3. Ferrures de fixation de colonne en amont de la DuoFlow. Eviter la formation de bulles d'air dans la colonne de tubage ou par solidarisation des raccords de colonne en amont de la vanne à boisseau de sélection en amont. Exécuter un tampon d'élution à travers les raccords jusqu'à ce que tout l'air est expulsé et une grosse goutte de tampon est présent. Temporairement arrêter l'écoulement du tampon. Retirer le bouchon relié à l'entrée de la colonne et placer une goutte de faible teneur en sel tampon (0% de B) sur le sommet de la colonne. Fixer la colonne sur les raccords en amont. Ayant à la fois l'entrée de la colonne et le raccord d'entrée débordant avec des gouttes de tampon assure une connexion sans bulles d'air. Si la colonne est utilisée pour la première fois, casser l'extrémité de sortie de la colonne. Fixer la prise sur les raccords et les tubes de colonne en aval vanne de sélection. Vérifiez tous les raccords sont bien fixés. Régler la limite de la contre-pression de 40 psi. Laver la colonne wvec 5 volumes de colonne (5 volumes de colonne = 5 ml) de tampon d'élution (0% de B) à un débit de 1 ml / minute. Continuer de lavage colonne, si nécessaire, jusqu'à ce que le pH, les tracés et de contre-pression UV se sont stabilisés. Laver la colonne avec 10 volumes de colonne (10 ml) de tampon de départ (100% B) à un débit de 1 ml / minute. Continuer de lavage colonne, si nécessaire, jusqu'à ce que les paramètres du système énumérés à l'étape précédente ainsi que la conductivité se sont stabilisés. La colonne HIC préparé ci-dessus est maintenant prêt pour le chargement de l'échantillon. Une fois toutes les colonnes à tester sont préparés, basculer manuellement les vannes de sélection de colonne à la position 1 (l'union) et arrêter l'écoulement du tampon. 4. Le chargement des échantillons Tubulure d'entrée Submerge échantillon dans 20 ml d'échantillon pour commencer le processus de chargement de l'échantillon dans la boucle d'échantillonnage dynamique. De la fenêtre de réglage manuel du logiciel BioLogic, passer charge boucle d'échantillonnage / laver la vanne en position 1 (échantillon) et l'échantillon de soupape de chargement à purger. Initier des actions dela pompe de chargement d'échantillon boucle, pour déterminer l'échantillon dans le tube de pompe à un débit de 1 ml / minute jusqu'à ce que immédiatement après l'échantillon atteint la soupape de chargement de l'échantillon. Cela supprime un tampon et / ou de l'air à partir de la ligne de charge de l'échantillon. Arrêter le débit de la pompe de chargement et placez la vanne de chargement de l'échantillon à partir de purge à charger. Redémarrer la pompe de chargement d'échantillon de boucle à un débit de 1 ml / minute jusqu'à ce que 10 ml de l'échantillon a été aspiré dans la boucle d'échantillonnage dynamique. Échantillon suffisant est maintenant chargé dans la boucle d'échantillonnage dynamique pour un maximum de 10 pistes séquentielles colonne HIC scoutisme. 5. Programmation de la méthode logicielle et exécution du Protocole de la colonne Scoutisme De la fenêtre de configuration du logiciel BioLogic, sélectionnez les périphériques du système marqués d'un astérisque dans le tableau 1. Sélectionnez 6 colonnes HIC pour le dosage. Programme d'un gradient linéaire de sel descendant et 6 colonnes méthode scoute, comme illustré dans le Tableau 3. Le programme est un procédé modification de la configuration du logiciel BioLogic colonne de CIH et a été optimisé pour l'application en cours. Une méthode 6-colonne dépistage est recommandé en raison des limitations collecteur de fractions. Tous les 7 colonnes peut être repéré si la méthode du programme est ajusté à collecter des volumes fraction supérieure. Ne pas ajouter de l'étape jusqu'à ce que le scoutisme programme est par ailleurs complète, que la sélection de la fonction reconnaissance empêche édition ultérieure. Commencez le long du scoutisme. Manuellement commencer tampon début (100% B) de débit, 1 ml / minute. Appuyez sur start sur le contrôleur de séparateur de commencer éluat 90% -10% flux de fractionnement entre le collecteur 12 ml de la culture fraction tube (position 1) et le collecteur plaque de 96 puits fraction (Position 2), respectivement. Note technique: Rappeler le collecteur plaque de 96 puits fraction est exploité hors ligne à partir du logiciel BioLogic. Exécuter la méthode du programme. Immédiatement après le démarrage du programme de la méthode run, appuyez sur Start sur le panneau de contrôle à l'écran de l'déconnecté fractionnement plaque de 96 puitsn collecteur. Si les deux collecteurs de fractions ne sont pas 100% synchrone, avancer manuellement la ligne de 96 puits collecteur de fraction la plaque que les progrès d'autres collecteurs de fractions pour le tube de collecte seconde fraction. Observez l'affichage en temps réel pour confirmer les paramètres d'exécution prévus. B contre-pression, la conductivité, et% (figure 4) sont gérés les paramètres qui peuvent être surveillés pour s'assurer de colonne à la colonne reproductibilité des conditions de fonctionnement. Positionnement de la vanne, le pH et le chargement des échantillons doivent également être surveillées. Tracés UV peuvent être comparés pour vérifier le débit-même grâce à des pics d'élution. Utiliser en ligne et de post-terme des techniques d'analyse d'éluat pour identifier le profil d'élution et la purification de la protéine d'intérêt («protéine cible" par exemple). Pour les échantillons contenant la GFP, d'observer l'élution en ligne à l'aide d'absorbance UV de la protéine unique à 397 nm. Comparer la GFP spécifique 397 nm l'absorbance de traçage à l'absorbance nm générale des protéines 280 traçage pour estimer la séparation par rapportet la purification en utilisant des supports différents HIC étant repéré (figure 5). Post-run analyse de la GFP et autres protéines cibles peut être accompli grâce à des méthodes multiples. Des aliquotes de pl 5-50 à partir des fractions de la plaque de 96 puits peuvent être transférés à une nouvelle plaque et analysés pour leur teneur en protéine spécifique par ELISA ou Western Blot, et teneur totale en protéines de chaque fraction peut être analysé en utilisant classique SDS-PAGE ou un système Experion électrophorèse microfluidique. Fluorescence de la GFP peut être détecté dans 12 des tubes de culture ml en utilisant la lumière UV (figure 6). Identification de la plupart des porteurs multimédia HIC peut être déterminée par comparaison de la GFP élution par rapport à d'autres protéines contenues dans l'échantillon. Purification avec les médias les plus prometteurs de HIC peut alors être optimisée en fonction d'autres paramètres, y compris le type et la concentration du tampon de début et de pH. Note technique: À l'issue de l'expérience, placer toutes les lignes d'entrée dans B1 Buffer (dégazéH 2 O) et rincer à fond les pompes, vannes, tubes et tous avec de l'eau. Suivez les instructions du fabricant pour le nettoyage et stockage à long terme du système de chromatographie et de colonnes de HIC. 6. Résultats représentatifs: Gradient représentant le sel HIC, la conductivité, et la pression de la colonne des pistes scoutisme sont présentés dans la figure 4. Le changement de la concentration en sel (ligne bleue), telle que mesurée par le pourcentage de tampon établie à partir de lignes tampons haute teneur en sel est typique de la méthodologie HIC. Que la concentration en sel diminue, protéines liés à l'éluer la colonne. De conductivité (ligne rouge), qui correspond à la concentration observée du sel, est mesurée en ligne immédiatement après les détecteurs Quadtec et UV. Le décalage entre gradient de sel et les tracés de conductivité indique le temps nécessaire pour le tampon se déplacer à partir de la mémoire tampon d'entrée, par l'intermédiaire du système, et au moniteur de conductivité. Tout au long de la série d'analyses, tla pression du système, il (lignes grises) et le pH restent relativement constants. La figure 5 montre les chromatogrammes de pistes séquentielles colonne HIC scoutisme. La détection en ligne des protéines totales (A 280, ligne bleue) et la GFP (A 397, ligne verte) est accompli en mesurant l'absorbance de la lumière à 280 nm et 397 nm, respectivement. Il est possible d'approcher l'abondance relative de la GFP et de la séparation pour chaque course le scoutisme en comparant les deux lignes. GFP liée aux colonnes testées HIC avec différents degrés d'affinité et de son profil d'élution varie. Sélection d'une colonne préféré HIC pour les purifications futurs repose sur l'identification de la colonne qui produit le pic d'élution plus forte GFP et le plus grand séparation d'avec d'autres protéines. Dans la figure 6, des tubes de culture pour les fractions 10, 12, 14, 16 et 18 de la FF Phenyl (haute sub) scoutisme terme ont été visualisés sous ambiante (fluorescente) léger et ultraviolet (UV). Les tubes ont été consultés deux face-avant (à gauche) et top-down (panneaux de droite) afin d'observer le spectre caractéristique d'émission GFP. GFP (green) est clairement détecté dans la fraction 14 dans les deux images UV. Ces données post-terme correspondent bien avec la détection en ligne de la GFP en mesurant l'absorbance éluat à 397 nm (A 397, ligne verte), qui identifie également Fraction 14 comme contenant le pic principal de la GFP élue. Le bleu diffuse dans le panneau UV gauche est la lumière émise par la lampe UV. Figure 1. Représentation schématique de ce protocole. Lysat bactérien contenant des protéines d'intérêt (GFP, protéine cible) est préparé, on le dilue dans un tampon équivalent en sel dans le tampon de départ chromatographie, et filtré. Une fois que le système de chromatographie liquide est préparé, l'échantillon est chargé et la protéine cible est séparée des autres protéines contenues in le lysat avec un milieu de chromatographie hydrophobe contenue dans une colonne de pré-emballé HIC. La méthode de séparation est répété plusieurs fois en utilisant les médias de chromatographie différents (dénommée colonne dépistage) afin de déterminer quels médias prévoit la séparation meilleure GFP. Les protéines éluées (éluat) est analysé en ligne en utilisant des détecteurs inclus dans le système de chromatographie et l'on recueille en plus petites fractions pour subséquente (après la course) analyse. Basé sur l'analyse en ligne et après la course de l'activité GFP et de la séparation, une colonne optimale HIC et moyennes chromatographique sont identifiés. Tableau 1. Les éléments clés du système de chromatographie utilisées dans le présent protocole. Figure 2. Schéma de Bio-Rad DuoFlow moyenne pression système de chromatographie liquide employé. Principales caractéristiques de la sydécoulent comprennent buffer blending automatisé, le chargement de l'échantillon pour les courses de colonnes séquentielles, la sélection automatique des colonnes de chromatographie différentes, une analyse en ligne de l'éluat, et la collecte en tandem de l'éluat fractionnée. Voir le texte et le tableau 1 pour plus de détails. Tableau 2 Caractéristiques. Biophysiques des médias HIC testé. Le nom de la colonne de CIH HiTrap est indicatif du ligand, la densité de ligand, et la taille du cordon. * FF = débit rapide; HP = haute performance. Agrandir la taille du cordon augmente la capacité de liaison du ligand et le débit. Diminuer la taille du talon augmente la résolution chromatographique. L'information tirée de documents fournis par le fabricant. Figure 3. Connexion de la colonne de GE Healthcare HiTrap HIC à Bio-Rad DuoFlow system.To l'écrou 1/4-28 Delrin amont unee virole (A1), un mâle Luer-à-raccord femelle 1/4-28 (B1) et mâle 1/16 "à raccord Luer femelle (C) sont connectés. Les raccords sont attacher à la colonne HiTrap après avoir été rincée avec un tampon et ayant toutes les bulles retiré. La sortie de la colonne est reliée à une femme 1/16 "à l'homme M6 de montage (D), Luer mâle-femelle pour raccord M6 (E), et Luer femelle-femelle 1 à / 4-28 raccord (B 2). Cette ensemble est relié à l'écrou Delrin 1/4-28 aval et virole (A 2). Le panneau supérieur montre les raccords séparés et le panneau inférieur montre les raccords assemblés. Étape # Volume (ml) Description Paramètres 1 0,00 Recueillir 1.0 mL fractions lors de l'exécution entière 2 0,00 La SuisseColonnes ch Colonne HIC une (Position 2) 3 0,00 Débit isocratique pH: 6,80 100% de B Volume: 2,00 mL Débit: 1,00 ml / min 4 2,00 Zéro de référence Quadtec 5 2,00 Zéro de référence Détecteur de rayons UV 6 2,00 Injecter l'échantillon Chargement d'échantillon Boucle dynamique Auto Injecter Valve Volume: 0,50 ml Débit: 1,00 ml / min 7 3,00 Débit isocratique pH: 6,80 100% de B Volume: 5,00 ml Débit: 1,00 ml / min 8 8,00 Dégradé linéaire pH: 6,80 100% de B -> B 0% Volume: 10,00 mL Débit: 1,00 ml/ Min 9 18,00 Débit isocratique pH: 6,80 B 0% Volume: 3,00 ml Débit: 1,00 ml / min 10 21,00 Débit isocratique pH: 6,80 100% de B Volume: 5,00 ml Débit: 1,00 ml / min 11 26,00 Colonnes de commutation Union (Position 1) Fin 26,00 Fin du Protocole Répète automatiquement avec 5 colonnes supplémentaires HIC (Positions 3-7) Scout de type Nombre de pistes: 6 Nombre d'étapes Repéré: 1 Tableau 3. Le logiciel de protocole pour BioLogic méthode scoute HIC employés. <img alt = "Figure 4" src = "/ files/ftp_upload/3060/3060fig4.jpg" /> Figure 4. Représentant gradient de sel HIC, la conductivité, et la pression de la colonne. Comme la concentration en sel (ligne bleue) diminue, la conductivité (ligne rouge) fait aussi bien. Le hors-jeu entre le gradient de sel et de tracés de conductivité indique le temps nécessaire pour le tampon de voyager de l'entrée du tampon à l'écran de conductivité. La pression du système (lignes grises) reste relativement constant pendant toute la durée de la course du scoutisme. Figure 5. Chromatogrammes compilés de colonne HiTrap HIC séquentielle dépistage pistes. La détection en ligne des protéines totales (A 280, ligne bleue) et la GFP (A 397, ligne verte) est accompli en mesurant l'absorbance de la lumière à 280 nm et 397 nm, respectivement. Dans cette série d'expériences, le pic de plus forte GFP a été observée avec élution de la FF Phenyl (haute sub) column. Le Phenyl FF (haute sous) la colonne est également apparu à fournir la plus grande séparation entre la GFP et d'autres protéines. Additionnelles 1 colonnes HiTrap ml HIC testé inclus substitution phényle écoulement rapide à faible (Phényl FF (faible sous)), butyle écoulement rapide (FF butyle),-S butyle écoulement rapide (S-butyle FF), et octyle écoulement rapide (FF octyle) . Figure 6. Représentant après la course de visualisation de la GFP dans l'éluat de l'échantillon. Fractions d'éluat ont été prélevés à un taux de 1/minute, et chacun a été analysé pour sa teneur GFP. Dans ce chiffre représentatif, tubes de culture pour les fractions 10, 12, 14, 16 et 18 de la FF Phenyl (haute sub) scoutisme terme ont été visualisés sous ambiante (fluorescente) et la lumière ultraviolette (UV). Les tubes ont été consultés deux face-avant (à gauche) et top-down (panneaux de droite). Le bleu diffuse dans le panneau UV gauche est la lumière émise par la lampe UV. GFP (green) est clairement détecté dans Fraction 14 dans les deux images UV. Le panneau supérieur indique la protéine totale (A280, ligne bleue) et la GFP (A 397, ligne verte) tracés chromatogramme des fractions de 5 étant visualisés.