自动疏水层析蛋白质纯化用柱选择

1。缓冲器和样品制备技术说明：所有的缓冲器应该冷藏，并应在4°C的冰或执行本协议的每一步，除非另有说明。低温是必不可少的，以防止被纯化的蛋白降解，以确保最佳运行条件。 HIC的媒体可能会产生不同的分离效果，如果在室温下操作，并应在4°C冷室或冷箱操作色谱系统。 准备500毫升以下的缓冲区：200毫米的NaH 2 PO 4（缓冲区A1），200毫米的Na 2 HPO 4，（缓冲A2），4.8米（NH 4）2 SO 4计 （缓冲区B2）。去离子水（缓冲区B1），也可以使用。德加的缓冲区，以确保最佳的色谱操作条件。最大化的系统将融合在一起A1和A2生成盐低磷酸盐洗脱缓冲液的缓冲，它将混合缓冲器B1和B2产生高盐硫酸铵起始缓冲液（2.4米（NH 4）2 SO 4计 ）。 准备20毫升的样品被装入混合10毫升含有10毫升缓冲B2纯化蛋白的细胞裂解。最终铵细胞裂解样品溶液的硫酸浓度应该约2.4米（NH 4）2 SO 4计 ，它大致相当于启动缓冲区。可以准备重新悬浮颗粒TE缓冲液中的细菌细胞（10毫米的Tris 1 mM的EDTA，pH值8.0），其次是超声或10分钟，除了1毫克/毫升溶菌酶和离心3700×G细胞裂解。 过滤器通过一个低蛋白结合0.45微米注射器过滤除去颗粒物从溶液中裂解缓冲液。样品置于冰上，直到它准备要加载到系统中。 2。 DuoFlow色谱系统的物理安装和水暖确保所有设备的电源和通讯连接。设备应在生物DuoFlow层析软件手动控制窗口可见。设备的摘要列于表1。系统和管道图的一个例证是，在图2。 附加泵工作站和系统最大化端口的端口编号如下逻辑顺序阀的电气连接。每个阀门上标明其各自的端口号以供将来参考。泵工作站和系统最大化作为主要的通讯连接计算机/控制器和色谱系统之间。阀门将自动识别并显示在软件时，连接到任何设备。 技术说明：虽然在手动模式下运行的色谱系统，独立控制阀。照顾到验证，配置所需的流动路径，尤其是当开关阀门，然后才开始BUFF呃流。 淹没特氟隆管到缓冲区中的A1，A2，B1和B2。确保足够量的缓冲区是整个协议，油管将继续保持淹没。准备500毫升缓冲液格A1，A2，B2和1 L缓冲B1就足够了。 帕朗柏样品加载阀和动态样本循环，如图2，每制造商的指示说明。样品阀入口（位置3），使用油管最小的长度可能将样品环。这将最大限度地减少样品稀释样品加载过程中。 油管的长度之间的样品，样品装载泵，装样阀入口（位置2）最小化。这将减少样品量要加载的样品环。 准备1/16“OD PEEK管的8个相同大小的对，每对，由1/4-28 female-to-1/4-28女工会联手，对连接两列1-8 7工会选择阀。行之关连柱选择阀位2-8稍后将进行测试的色谱列取代。工会与嵌入位置1将保持作为层析柱旁路。 技术说明：确保每油管连接到相同的位置都列选择阀。 4波长的紫外/可见光检测器（QuadTec）灯和固定波长280纳米紫外检测灯打开。被此协议QuadTec测量到波长214纳米，280纳米和397纳米。两个固定波长的紫外探测器QuadTec的测量280 nm处，提供了系统冗余，确保数据的有效性。 确认所有的探测器校准每制造商的指示。背压调节是必要的探测器，以减少气泡的积累，并应安装流探测器，但pH监测流。 这里介绍该系统包括两个fractio列印收藏家，它提供了大量方便运行后洗脱液分析。附加馏分收集器，流分配器阀，分路控制器，如图2所示。馏分收集器连接到放置分路阀1将收集900μL洗脱组分在12毫升培养管，而馏分收集器连接到位置2，将收集在96孔板100μL洗脱组分。 位置2馏分收集器，分路阀，控制器和分配器经营离线色谱工作站。分离器控制器包含在Bio-Rad公司Econo梯度泵;然而，不使用泵设备组件。 Econo梯度泵将显示一个“％分割”设置选项时，分路阀连接到它。 集至10％分割。位置1馏分收集器收集洗脱液（900μL/次）的90％，位置2馏分收集器将收集10％（100μL/次）。馏分收集器将允许为收藏家分数号码相互对应的同步推进。 取代位置2与微孔板下降头的一小部分收藏家的标准分数收藏家下降头。在的微孔板下降头有一个较小的光圈，它允许墨滴尺寸小50％（即25微升，而不是标准的50μL）收集和收集≤500μL分数时是特别有益。 使用屏幕上的控制面板，设置位置2馏分收集器，收集1个样本/分钟的速度在96孔板和先进的分数。分路控制器和位置2馏分收集器将手动启动后立即开始的第一色谱运行。 刷新位置2馏分收集器具有缓冲B1和微孔板下降头。 3。吸系统线路，编程运行方法，EquilibratING疏水层析柱淹没的A1，A2，B1，B2，素工作站泵脱气缓冲器与系统最大化入口线，冲洗样品回路，并刷新每色谱系统制造商的指示。所有4最大化系统入口总吸步骤（A1，A2，B1和B2），以消除剩余的气泡。 准备系统，需要通过生物软件系统控制器的手动操作。确认样品负载阀和列选择阀门之前，要启动缓冲流的正确定位。 准备开始通过在3.4-3.5步骤描述了系统，手动1毫升/分钟的流量洗脱缓冲（0％）。 在生物程序软件的设置窗口，选择“使用缓冲区交融”，“硫酸铵磷酸盐缓冲”。确认缓冲器格A1，A2，B1和B2的设置窗口中，对应于那些有准备的。 手动设置洗脱缓冲液1毫升/分钟的流量（0％B级）。观察背压，电导率，紫外追查，pH值保持一致，并在正常运行范围内。异常指示，应以诉讼解决之前的空气或列堵塞。 洗脱缓冲液5毫升，冲洗所有8列选择线。首先停止流动，同时设置列选择阀门位置2，并恢复1毫升/分钟的流量，0％B重复位置列选择3-8线。 将1毫升HiTrap HIC的列栏选择阀的位置2-8。与一列一次完成步骤3.8-3.13。注意HIC的列放置在其中选择阀的位置。 表2中列出的HIC柱介质特性的总结。 GE医疗HiTrap柱Bio-Rad公司DuoFlow系统的物理连接需要利用1/4-28配件，M6和鲁尔配件系列。拆下连接的位置2列选择阀工会。一lign Bio-Rad公司和通用电气医疗装置如图3所示。 将上游柱接头的DuoFlow。避免气泡被困在列管或牢固连接上游柱接头上游选择阀门配件。洗脱缓冲液，直到所有的空气被排出一个缓冲的大幅下降是目前贯穿配件。暂时停止缓冲流。 卸下连接到色谱柱入口的塞子，将大幅下降的低盐缓冲（0％B级）列的顶部。将列向上游的配件。列进口和进口配件滴缓冲区满溢，确保无气泡连接。 如果该列正在为第一次使用，折断柱出口端。将出口到下游的柱接头和选择阀油管。检查所有的配件都紧紧系住。 设置背压限制到40磅。洗列瓦特第i列卷5（5个柱体积= 5毫升），洗脱缓冲液（0％B级）在1毫升/分钟的流量。继续列洗，如有必要，直到pH值，紫外线追查和背压稳定。 洗柱10个柱体积（10毫升）（100％B级）在1毫升/分钟的流量开始缓冲。继续列洗，如有必要，直到稳定系统参数列在前面的步骤以及电导率。 现在准备装样的HIC列准备。一旦准备进行测试的所有列，手动切换列选择阀门位置1（联盟）和停止缓冲流。 4。样品装载淹没样品放入20毫升的样品入口管动态样本循环开始装载样本的过程。从生物软件手动设置窗口，切换样品回路负载/冲洗阀门位置1（样品）和样品装载阀，清除。 发起行动样品循环加载泵，绘制成的泵管样品在1毫升/分钟的流速直至样品后立即到达装样阀。这消除缓冲区和/或空气样本载重线。 停止加载泵的流量和清除装样阀切换到加载。样品循环加载已绘制成动态样本循环泵，直到10毫升的样品在1毫升/分钟的流量重新启动。 现在足够的样本动态样本循环装入多达10 HIC的顺序列球探运行。 5。编程软件的方法和运行列童军议定书“ 从生物软件的设置窗口，选择表1中的星号标记的设备系统。 选择6 HIC的列法。方案线性降盐梯度和6列侦察方法，如表3所示。该方法的程序是一个modificat离子和生物软件HIC的列设置为当前应用程序进行了优化。 一个6列侦察方法的建议，由于馏分收集器的限制。全部7列，可侦察，如果该程序的方法进行调整，以收集较大部分卷。不添加球探步骤，直到该程序，否则是完整的，选择球探功能，防止后续编辑。 开始球探运行。手动开始启动缓冲区（100％B级）的流量，1毫升/分钟。按上分器控制器开始展开，12毫升培养管馏分收集器（位置1）和96孔板馏分收集器（位置2），分别为90％-10％洗脱液之间的数据流的分裂。技术说明：召回的96孔板馏分收集从生物软件脱机操作。 运行程序的方法。立即启动程序的方法运行后，按开始上离线96孔板fractio的的屏幕上的控制面板列印收藏家。如果两个分数收藏家是不是100％同步，手动推进其他馏分收集的进步第二部分收集管脱机96孔板馏分收集器。 观察实时显示，以确认预期的运行参数。背压，电导率和％B级（图4）的运行参数，可以进行监测，以确保列列的运行条件下的可重复性。阀门定位器，pH值，装样，也应监测。紫外线轨迹，可以进行比较以验证通过流洗脱峰相似。 利用线和运行后的洗脱液分析技术，以确定洗脱的文件和提纯感兴趣的蛋白质（即“目标蛋白”）。 含绿色荧光蛋白的样本，观察洗脱行使用蛋白质的独特的紫外吸收在397 nm。比较具体的GFP-397 nm处的吸光度追踪一般蛋白质280 nm处的吸光度跟踪估计的相对分离和净化使用不同的HIC的媒体侦察（图5）。 运行后GFP和其他目标蛋白的分析，可以通过多种方法来完成。从96孔板分数等分5-50微升可以转移到一个新的板块和特定的蛋白质含量测定ELISA或免疫印迹，每个部分的总蛋白含量可以使用常规的SDS-PAGE或分析的Experion微电泳系统。 GFP荧光可检测12毫升培养使用紫外线光管（ 图6）。 鉴定最有前途的抗HIC媒体可以通过绿色荧光蛋白洗脱样品中的其他蛋白质的相对比较确定。最有前途的抗HIC介质的净化，然后可以根据其他参数，包括起始缓冲液和pH值的类型和浓度优化。 技术说明：在实验结束时，所有进口线放置到缓冲区B1（脱气H 2 O），彻底用清水冲洗，泵，阀，所有管。按照制造商的指示为色谱系统和HIC柱的清洗和长期储存。 6。代表性成果： 在图4代表HIC的盐梯度，导电性，和列的球探运行的压力。变化中的盐分浓度（蓝线）从高盐缓冲线绘制的缓冲区的百分比计算，是典型的HIC的方法。随着盐的浓度降低，蛋白质势必列流出。电导率（红线），对应观察到的盐分浓度，测量行紧随QuadTec和紫外探测器。之间的盐梯度和电导率描抵销表示需要缓冲区的时间，前往从缓冲区入口，通过该系统，电导率显示器。整个样品运行，T他系统压​​力（灰线）和pH值保持相对稳定。 图5显示了HIC的顺序列球探运行的色谱图。总蛋白（280，蓝线）和GFP（一个397，绿线）的在线检测是通过测量光吸收在280 nm和397 nm处，分别。这是可能的近似相对GFP的丰度和每个球探运行的分离，通过比较两行。 GFP的绑定测试HIC的列不同程度的亲和力和其流出曲线变化。选择首选未来纯化的抗HIC列的基础上确定产生清晰的绿色荧光蛋白洗脱峰和其他蛋白质的分离最大的列。 在图6中，文化分数10，12，14，16，和球探运行苯基FF（高子）18管室温下的可视化（荧光）灯和超紫外线（UV）光。管被看作脸向前（左侧面板）和自上而下（右图），以观察的特点GFP发射光谱。 GFP（绿色）显然是在紫外图像检测分数14。这些运行后的数据符合很好的GFP在线检测洗脱液吸光度测量397纳米（一397，绿线），这也标识为包含的洗脱绿色荧光蛋白的主要高峰分数14。从紫外灯发出的光弥漫在左边的紫外线面板蓝色。 图1。此协议的示意图。准备细菌裂解液含有蛋白（GFP的靶蛋白），稀释成一个高盐缓冲相当于色谱开始缓冲，过滤。一旦液相色谱系统的准备，样品装载和目标蛋白从其他蛋白质分离载我n的使用在预包装的抗HIC列载疏水层析介质的裂解。分离方法是反复多次使用不同的层析介质（简称列侦察），以确定哪些媒体提供最好的绿色荧光蛋白分离。 （洗脱液）洗脱蛋白质分析行使用色谱系统包括探测器收集到较小的分数为后续（运行后）分析。基于GFP的活动在线路和运行后的分析和分离，HIC的最佳列和色谱介质确定。 表1。重点色谱系统，在这个协议中使用的组件。 图2。Bio-Rad公司DuoFlow中压液相色谱系统的框图。 SY的主要功能阻止包括自动缓冲混合，样品装载顺序列运行，自动选择不同的层析柱，洗脱液行分析，并串联收集分馏洗脱液。见文本的细节和表1。 HIC的媒体表2。生物物理特性测试。 HiTrap HIC的列的名称是指示性的配体，配基密度，粒径。 *法郎=快速流动;惠普高性能。粒径较大增加配体结合能力和流量。较小的粒径增加色谱分辨率。从制造商提供的文学中获得的信息。 图3。 Bio-Rad公司DuoFlow system.To上游1/4-28聚甲醛螺母连接的GE医疗HiTrap HIC的列1露儿对女性男性1/4-28接头（B1）和男性的1/16“女性鲁尔接头（C）是连接配件后，被附加到HiTrap列第二套圈（A1），缓冲液冲洗，并删除所有的气泡。列插座连接到一个女性的1/16“的男性M6的接头（D），男露儿女性M6的配件（E）和女性露儿对女性1 / 4-28拟合“（2）。整个装配连接到下游的1/4-28聚甲醛螺母和垫圈（2）。上游面板显示装置分离和较低的面板显示配件组装。 步骤＃ 体积（mL） 描述 参数 1 0.00 整个运行过程中收集1.0毫升分数 2 0.00 SWITCH列疏水层析柱1 （位置2） 3 0.00 等梯度流 PH：6.80 100％B级体积：2.00毫升流速：1.00 mL / min的 4 2.00 零基准 QuadTec 5 2.00 零基准紫外探测器 6 2.00 注入样品样品负载动态循环自动进样阀体积：0.50毫升流速：1.00 mL / min的 7 3.00 等梯度流 PH：6.80 100％B级体积：5.00毫升流速：1.00 mL / min的 8 8.00 线性渐变 PH：6.80 乙 – > 0％B级100％ 成交量：10.00毫升流量：1.00毫升。/分钟 9 18.00 等梯度流 PH：6.80 0％B级体积：3.00毫升流速：1.00 mL / min的 10 21.00 等梯度流 PH：6.80 100％B级体积：5.00毫升流速：1.00 mL / min的 11 26.00 开关列工会 （位置1） 结束 26.00 议定书结束自动重复5 HIC的额外列 （位置3-7） 侦察型 运行数：6 步数侦察：1 表3。生物HIC的侦察方法的软件协议。 <IMG ALT =“图4”的src =“/ files/ftp_upload/3060/3060fig4.jpg”/> 图4。HIC的代表盐梯度，电导率，列压力。作为盐的浓度（蓝线）减小，电导率（红线）也是如此。盐梯度和电导率追查之间的抵销表示需要的缓冲区，从缓冲区入口电导率显示器的时间。系统压力（灰线）的的球探运行时间保持相对恒定。 图5：编译顺序HiTrap HIC的柱色谱的球探运行。总蛋白（280，蓝线）和GFP（一个397，绿线）的在线检测是通过测量光吸收在280 nm和397 nm处，分别。在这一系列的实验中，最清晰的绿色荧光蛋白洗脱峰观察与苯基FF（高子）Column。苯基FF（高子）列也出现了提供绿色荧光蛋白和其他蛋白质之间的最大分离。增加1毫升HiTrap HIC的列测试，包括苯快流低取代（苯基FF（低子）），丁基快速流动（丁基法郎），丁基-S的快速流动（丁基-FF），辛基快速流动（辛基法郎） 。 图6。代表运行后GFP样品洗脱液的可视化。收集洗脱组分在一个1/minute率，每个绿色荧光蛋白的含量进行分析。在这个代表性的人物，文化分数10，12，14，16，和球探运行苯基FF（高子）18管，室温下（荧光）灯和紫外线（UV）光的可视化。管被看作都面临着向前（左侧面板）和自上而下（右图）。从紫外灯发出的光弥漫在左边的紫外线面板蓝色。显然在压裂检测GFP（绿色）TION 14紫外图像。上游面板显示总蛋白（A280的，蓝线）和GFP（一个397，绿线）5可视化组分的色谱踪迹。