Préparation E18 neurones de rat corticale compartimentation dans un dispositif microfluidique

Préparation des neurones de rat fœtal E18 corticales pour compartimentation Avant de commencer, il est important de réchauffer tous les médias et les réactifs nécessaires à 37 ° C. Il est également important de stériliser tout ce qui est utilisé pour la préparation des cellules (par exemple, les ampoules de caoutchouc, supports pour tubes, des bouteilles médias, etc), et celui qui est placé dans la hotte, en essuyant avec de l'éthanol à 70%. Placez deux morceaux de cortex de rat fœtal E18 (un cerveau, précédemment disséqué) dans un tube de 15 ml contenant 1 ml glacée sans calcium magnésium tampon sans dissection. Ajouter 1 ml de 0,25% de trypsine-EDTA au cortex dans le tampon de la dissection, portant le volume final de 2 ml et la concentration de trypsine finale à 0,125%. Placez le tube de 15 ml dans un bain d'eau à 37 ° C pendant 8 minutes. Pendant ce temps, le feu polonaise de verre 3 pipettes Pasteur, formant des ouvertures plus petites successivement, dans une enceinte de biosécurité pour aider à maintenir la stérilité. Après l'incubation 8 minutes du cortex, ajouter 10 ml de DMEM contenant 10% de FBS au cortex pour aider à arrêter la réaction trypsine. Centrifuger le tube de 15 ml contenant du cortex et DMEM/10% de FBS à 2500 rpm pendant 2 minutes. Dans le cabinet de biosécurité, éliminer le surnageant du cortex en utilisant une pipette Pasteur en verre avec des ventouses ci-joint. Soyez prudent de ne pas déranger ou déloger le culot. Ajouter 1 ml de NMB à la pastille cortex et délicatement la pipette de haut en bas. Il est très important pour éviter de créer des bulles d'air tout en haut et en bas de pipetage, comme les bulles d'air peuvent endommager les cellules par oxydation. Utilisez le feu poli pipette Pasteur avec la plus large ouverture de triturer le cortex en attachant une poire en caoutchouc stériles jusqu'à la fin et pipetage haut et en bas 5 fois, encore une fois en faisant attention à ne pas introduire de bulles d'air. Continuez ce processus avec les 2 autres pipettes en verre, chacun avec une taille d'ouverture diminué. Après trituration, centrifuger le bas des cellules de nouveau à 2500 rpm pendant 2 minutes. Après centrifugation, une fois de retirer le surnageant et remettre le culot cellulaire dans 2 ml de MNB. Filtrer la solution de cellules en suspension à travers un tamis 45 cellules um. Colorer les cellules au bleu trypan, compté, et chargé dans les appareils. En général, nous charge de 20 ul de cellules par l'appareil. Remarque: la concentration finale de cellules est typiquement comprise entre 2,5 millions de cellules / ml et 8 millions de cellules / ml Chargement des cellules Après que les cellules ont été comptées, il est temps de charger les cellules de l'appareil: Apportez les dispositifs précédemment préparés contenant MNB dans l'armoire de biosécurité afin de maintenir la stérilité. Retirer l'excès des médias provenant des puits par aspiration sous vide. Cependant, soyez prudent pour éviter d'enlever tous les médias – il doit y avoir certains médias dans le chenal principal. Appliquer 20 ul de cellules dans le réservoir en haut à gauche de l'appareil (voir schéma si nécessaire). Le flux de cellules dans l'appareil et fixer à la surface traitée PLL. Après le chargement, placer les appareils contenant des cellules de retour dans un incubateur pendant 10 minutes pour permettre aux cellules d'attacher. Après 10 minutes, remplir les réservoirs avec les médias et les dispositifs replacer dans l'incubateur.