Preparación de neuronas de rata E18 cortical de compartimentación en un dispositivo de microfluidos

Preparación de las neuronas de ratas fetales E18 cortical de compartimentación Antes de salir, es importante para calentar todos los medios necesarios y los reactivos a 37 ° C. También es importante esterilizar todo lo que se utiliza para la preparación de las células (por ejemplo, los bulbos de goma, bastidores de tubos, botellas de los medios de comunicación, etc), y lo que se coloca en la capilla, al lavarlo con etanol al 70%. Coloque dos trozos de corteza de rata fetal E18 (un cerebro, previamente disecados) en un tubo de 15 ml que contiene 1 ml de helado de calcio sin magnesio libre de tampón de disección. Añadir 1 ml de 0,25% de tripsina-EDTA a la corteza en un tampón de disección, con lo que el volumen final de 2 ml y la concentración final de tripsina al 0,125%. Coloque el tubo de 15 ml en un baño de agua 37 º C durante 8 minutos. Durante este tiempo, el fuego de uñas 3 pipetas Pasteur de vidrio, formando aberturas cada vez más pequeños, en un gabinete de bioseguridad para ayudar a mantener la esterilidad. Después de la incubación de 8 minutos de la corteza, agregar 10 ml de DMEM con FBS al 10% de la corteza cerebral para ayudar a detener la reacción de la tripsina. Centrifugar el tubo de 15 ml que contiene la corteza y DMEM/10% FBS a 2500 rpm durante 2 minutos. En la cabina de bioseguridad, separar el sobrenadante de la corteza con una pipeta Pasteur de vidrio con aspiración al vacío adjunto. Tenga cuidado de no perturbar o desalojar el pellet. Añadir 1 ml de la NMB a la bolita corteza y suavemente la pipeta hacia arriba y abajo. Es muy importante evitar la creación de burbujas de aire, mientras que pipeta hacia arriba y abajo, como las burbujas de aire pueden dañar las células de la oxidación. El uso del fuego pulido pipeta Pasteur con la más amplia apertura para triturar la corteza adjuntando una pera de goma estériles para el final y pipeta hacia arriba y abajo 5 veces, de nuevo teniendo cuidado de no introducir burbujas de aire. Continuar este proceso con la pipetas de vidrio otros dos, cada uno con un tamaño de abertura menor. Después de la trituración, se centrifuga a las células de nuevo a 2500 rpm durante 2 minutos. Después de la centrifugación, una vez más, separar el sobrenadante y resuspender el botón celular en 2 ml de NBM. Filtrar la solución de células resuspendidas a través de un colador de la célula 45 um. Tinción de las células con azul de tripano, se cuentan y se carga en los dispositivos. Por lo general carga de 20 ul de células por dispositivo. Nota: la concentración final de células es típicamente entre 2,5 millones de células / ml y las células de 8 millones / ml Carga de las células Después que las células han sido contadas, es el momento de la carga de las células en el dispositivo: Lleve los dispositivos previamente preparados que contienen NBM en la cabina de bioseguridad para mantener la esterilidad. Quite el exceso de los pozos de succión al vacío. Sin embargo, tenga cuidado para evitar la eliminación de todos los medios de comunicación – que debe haber algunos medios de comunicación en el canal principal. Aplicar 20 ul de células para el depósito superior izquierda del dispositivo (vea el diagrama si es necesario). Las células de flujo en el dispositivo y se adhieren a la superficie tratada PLL. Después de la carga, coloque los dispositivos que contienen las células de nuevo en una incubadora durante 10 minutos para permitir que las células que desea adjuntar. Después de 10 minutos, llenar los depósitos con los medios de comunicación y dispositivos de volver a meterla en la incubadora.