Voorbereiden E18 Corticale Rat Neuronen voor Compartimentering in een microfluïdische apparaat

Voorbereiden E18 Foetale Rat corticale neuronen voor Compartimentering Voordat u begint, is het belangrijk om alle nodige media en reagentia warm tot 37 ° C. Het is ook belangrijk om te steriliseren alles dat wordt gebruikt voor het bereiden van de cellen (bijv. rubber bollen, reageerbuisrekken, media flessen, enz.), en dat die wordt geplaatst in de motorkap, door af te vegen af ​​met 70% ethanol. Leg twee stukken van de E18 Foetale Rat Cortex (een brein, eerder ontleed) in een 15 ml buis met daarin 1 ml ijskoud Calcium-Magnesium free-free dissectie buffer. Voeg 1 ml van 0,25% trypsine-EDTA voor de cortex in dissectie buffer, waardoor het uiteindelijke volume van 2 ml trypsine en de uiteindelijke concentratie 0,125%. Plaats de 15 ml buis in een 37 ° C waterbad gedurende 8 minuten. Gedurende deze tijd, brand polish 3 glazen pipetten Pasteur, de vorming van achtereenvolgens kleinere openingen, in een kast bioveiligheid te helpen handhaven steriliteit. Na de 8 minuten incubatie van de cortex, voeg 10 ml DMEM met 10% FBS naar de cortex om de trypsine reactie te stoppen. Centrifugeer de 15 ml buis met de cortex en de DMEM/10% FBS bij 2500 rpm gedurende 2 minuten. In de bioveiligheid kabinet, verwijder het supernatans van de cortex met behulp van een glazen Pasteur pipet met vacuüm zuigen bevestigd. Wees voorzichtig niet te verstoren of los de pellet. Voeg 1 ml van NMB naar de cortex pellet en voorzichtig pipet op en neer. Het is heel belangrijk om te voorkomen dat het creëren van luchtbellen tijdens het pipetteren op en neer, omdat de luchtbellen kunnen de cellen beschadigen door oxidatie. Gebruik de brand-gepolijste Pasteur pipet met de breedste opening naar de cortex vermaal door het aanbrengen van een steriele rubber bol naar het einde en op en neer pipetteren 5 keer, opnieuw en let niet om luchtbellen te introduceren. Herhaal dit proces met de andere 2 glazen pipetten, elk met een verminderde opening grootte. Na tritureren, centrifuge beneden de cellen weer bij 2500 rpm gedurende 2 minuten. Na het centrifugeren, nogmaals de bovenstaande vloeistof en resuspendeer de celpellet in 2 ml van de NBM. Filter de geresuspendeerde cel oplossing door een 45 um cel zeef. Vlekken op de cellen met trypaan blauw, geteld, en geladen in de apparaten. We meestal belasting 20 ul van cellen per apparaat. Let op: de uiteindelijke concentratie van cellen is meestal tussen de 2,5 miljoen cellen / ml en 8 miljoen cellen / ml Het laden van de cellen Nadat de cellen zijn geteld, is het tijd om de cellen laden in het apparaat: Breng de vooraf bereide hulpmiddelen die NBM in de bioveiligheid kabinet om de steriliteit te behouden. Verwijder het overtollige papier uit de putten door afzuiging. Wees echter voorzichtig om te voorkomen dat het verwijderen van alle van de media – er moet worden sommige media in het hoofdkanaal. Van toepassing zijn 20 ul van cellen aan de linker reservoir van het apparaat (zie schema indien nodig). De cellen stroom in het apparaat en hechten aan de PLL behandelde oppervlak. Na het laden, plaatst u de apparaten bevattende cellen terug in een incubator gedurende 10 minuten om de cellen te hechten. Na 10 minuten, vul de reservoirs met media-apparaten en plaats terug in de incubator.