Maus in Utero Elektroporation: Kontrollierte Spatiotemporal Gene Transefection

1. Vorbereitung der Kapillar-und DNA-Lösung zur Injektion Purify Plasmid-DNA mit einem Maxi-Prep oder gleichwertiges Verfahren, um zu einer endgültigen Konzentration von 2-3 ug / ul. Aliquot 100 ug DNA, fügen Sie 10 &mgr; l der schnellen grünen Farbstoff (1% Aktien) und TE (10 mM Tris Base, 1mM EDTA-Lösung, pH 8,0) und stellen ein Volumen von 100 ul die endgültige DNA-Konzentration zur Injektion Mix 1 g / machen ul. Die Konzentration von Plasmid-DNA verändert werden kann, hängt von der Größe des Plasmids, und auch ihre Transfektionseffizienz, die einzeln geprüft werden muss. Drehen Sie die DNA-Lösung für 5 Minuten bei 14.000 RPM bei Raumtemperatur und sammeln Überstand, um alle Rückstände zu entfernen. Ziehen Sie eine Glaskapillare tubea Glaskapillaren mit einer Mikropipette Abzieher. Pinch off der Spitze mit einer Pinzette, um die Spitze hat einen Durchmesser von 20-30 um. Messen Sie 800 um-1 mm von der Spitze und überprüfen Sie die Außendurchmesser von weniger als 60 pm (Abb. 1A). Schließen Sie die Kapillare zu den Mikromanipulator, und füllen Sie mit Mineralöl. Um die Kapillare mit der DNA-Lösung, tauchen die Spitze in die Lösung zu füllen und zu saugen bis die DNA-Lösung. 2. Stick-Platin-Elektroden Hier haben wir Stick Platinelektroden (Nepe Gen, CUY611P2-1) in oberflächennahen Bereich des Gehirns, wie der Cortex (Abb. 1F) elektroporieren. 3. Vorbereitung von Mikroelektroden Verwenden Sie Mikro-Elektroden in tiefen Teilen des Gehirns (dh, Thalamus und Hypothalamus) (Abb. 2B-E) elektroporiert. Ein Ende des Wolfram (für negative Elektroden) und Platin (für positive Elektroden) Drähte auf vergoldeten gewickelt und fixiert mit Parafilm. Führen Sie den Draht um den Stamm ein Wattestäbchen und wickeln Sie beide Enden mit Parafilm (Abb. 1B). Gleichmäßig schärfen die Spitze des Drahtes mit Sandpapier, bis sie 20-30 um Außendurchmesser und 60 pm von 800 um-1 mm von der Spitze (Abb. 1C und D) erreicht. Tragen Sie eine dünne Schicht Nagellack auf den Draht für die Isolierung. Nach der Nagellack getrocknet ist, verwenden Sie ein Aceton getränkten Wattestäbchen, um es von der Spitze (etwa 200 um von der Spitze) zu entfernen. Wichtiger Hinweis: Um Schäden an der Maus die Gebärmutter zu verhindern, ist der Anteil innerhalb von 800 um-1 mm von der Spitze sollte nicht mehr als 70 um im Durchmesser (Abb. 1E) werden. 4. Vorbereitung der Operation Anesthetize eine schwangere Maus (E9.5-E15.5). Wir zeigen, Betäubung mit pharmazeutischer Qualität Natrium-Pentobarbital (Tabelle II; 50 ug pro Gramm Körpergewicht, intraperitoneal injiziert, und warten Sie 5 min). Alternativen zum Natrium-Pentobarbital als Narkosemittel beinhalten Ketamin / Xylazin Injektion oder Gas Anästhetika (Gas ist bevorzugt kurzer Dauer Verfahren). Die Injektion mit Aufmerksamkeit sollte getan werden, um alle Organe zu vermeiden, sonst wird es dazu führen, dass die Gebärmutter schädigen oder töten Tier. Als erfolgreiche IP geschehen ist, ist die Überlebensrate mehr als 95%. Auch die Chirurgie kann in Open-Air-Umgebung durchgeführt werden. Bevor begann die Operation, Test für eine fehlende Reaktion durch das Tier zu kneifen ihre Fußspitze Betäubung bestätigen. Shave das Haar aus dem Bauch mit einer Rasierklinge und 50% EtOH. Bereiten Sie die Haut mit wechselnden scrubs von betadine und Alkohol (70%). Machen Sie einen Schnitt am Bauch-Mittellinie mit einer feinen Schere und ziehen Sie alle Uterushörner vorsichtig auf 37 ° C vorgewärmten Phosphat-gepufferter Salzlösung (PBS)-angefeuchtet Baumwollgaze, die um die Wunde gelegt wird. Halten Sie die Gebärmutter feucht mit PBS die ganze Zeit. Halten Sie eine flexible Glasfaser-Kabel zwischen dem Zeige-und Mittelfinger und legen Sie es unter dem Uterushorn. Saubere Kabel mit 70% EtOH vor dem Gebrauch. Kein Mikroskop oder Lupe ist für die Visualisierung benötigt. Position Gebärmutter zwischen den Glasfaser-Licht-Optik-Kabel und den Daumen, und drücken Sie sanft nach oben zu drücken den Embryo näher an der Gebärmutterwand. 5. Die Injektion von DNA und Elektroporation Als Embryo positioniert ist, legen Glas sorgfältig Kapillare in Ziel Herzkammer und spritzen ca. 1 ul DNA-Lösung (Abb. 2A). Für die Elektroporation auf oberflächliche Teil des brainIf Verwendung mit Stick Platin-Elektroden für electoporation, legen Sie die Elektroden außerhalb der Gebärmutter und gelten vorgeschlagen Rechtecksignale Stromimpulse nach Herstellung der Anweisung (Tabelle I). Wenn usingFor Elektroporation zu tieferen Teil des Gehirns, nmicro Elektroporation werden eedle Typ Elektroden verwendet. Iinsert einem feinen Wolfram negative Elektrode in die DNA injiziert Ventrikel und einer Platin-Elektrode in die Gebärmutter und Ort Zielregion zwischen zwei Elektroden, dann schlug Rechtecksignale Stromimpulse (Tabelle I) (Abb. 2B) gelten. 6. Beitrag Elektroporation Legen Sie die Uterushorn zurück in seine original Lage mit und fügen Sie 500 ul von 37 ° C vorgewärmten PBS. Suture die innere Schicht mit chirurgischem Nahtmaterial und schließen äußere Schicht mit einem 9 mm autoclipauto Clip. Legen Sie Tiere auf einem Heizkissen für 2 Stunden, damit aus der Narkose. Analgetika wie Carprofen oder Buprenorphin kann für postoperative Schmerzen verabreicht werden. 7. Repräsentative Ergebnisse: Einige Beispiele der kortikalen Elektroporation von pCAG-EYFP konstruieren mit Stick Platinelektroden zu verschiedenen Zeitpunkten sind in Abbildung Abbildung 32 dargestellt. Brains sind E13.5, E14.5 und E15.5 elektroporiert und geerntet postnatalen Tag (P) 6. ADie ntibody Färbung RORC zeigt Lage der Schicht 4 und die Position der EYFP transfizierten Zellen durch GFP Antikörper-Färbung werden aufgedeckt, und die beiden Bilder sind super verhängt (Abb. 3A und B). Labeled kortikalen Zellen Schicht der kortikalen Zellen elektroporiert unterscheidet sich deutlich in jedem Experiment (Abb. 32), die zeitabhängige Elektroporation macht Corticalis-spezifische GOF / LOF möglich suggeriert. Die Lebensfähigkeit von Embryonen und die Effizienz der Transfektion von Zellen variiert nach Alter des Embryos und die Lage der Elektroporation abhängig. Die Proben in Tabelle 1 aufgelistet sind, jedoch sollten die Bedingungen für jede Elektroporation je auf der Bühne und ein Teil des Gehirns optimiert werden. Elektroporation in eine tiefe Gewebe wie Thalamus und Hypothalamus mit der Verwendung von Platin-Elektroden-Stick geben oft geringe Effizienz (Tabelle 1). Dieses Problem kann durch Verwendung von Mikro-Elektroden whichelectrodes, die tiefen Teile des Gehirns erreichen wird gelöst werden. Abbildung 3 4 zeigt beispielsweise der pCAG-EYFP Elektroporation in den Entwicklungsländern Zwischenhirn. Plasmid-DNA-Lösung wird in der 3. Ventrikel bei E11.5 injiziert, gefolgt von Mikro-Elektroporation (Abb. 3C4C). Die Elektroporation Bereich ist in den Thalamus beschränkt, wo die meisten Axone zum Kortex (Abb. 3B4B). Axon-Projektion der Schicht 4 des Kortex kann auch visualisiert EYFP, die bis fillesfills das gesamte Neuron. (Abb. 3A4A). Abbildung 1. Cartoon schematische demonstriert die richtige Form der Kapillare. (A) A Glaskapillare gezogen wird mit einer Mikropipette puller bestimmte Form zu machen. Ein Tipp ist abgeschnürt durch Zangengeburt zu 20-30 um zu machen. Messen Sie 800 um-1mm von der Spitze (rote Klammer) und stellen Sie sicher, dass externe Durchmesser von weniger als 60 pm (grüne Klammer) ist. (B) Ein Ende des Wolfram-oder Platin-Drähte auf vergoldeten gewickelt und fixiert mit Parafilm. Dann nutzen Sie Schleifpapier, ihre Spitze stellen, um 20-30 um Außendurchmesser und 60 um 1 mm von der Spitze zu werden. (C) Bild von der Wolfram-Draht vor der Formgebung. (D) Bild von der Wolframdraht nach der Formgebung. (E) Bild von der Wolframdraht nach dem Auftragen dünn Nagellack. Maßstabsbalken in E ist 10 pm (kleinste Skala) für CE. (F) Stick Platinelektroden (Nepa Gen. CUY611P2-1). Balken in F ist 2 mm. Abbildung 2. Cartoon-Schema des chirurgischen Eingriffs. (A) Schematische Darstellung der Injektion in Seitenventrikel oder großen Embryonen (links) und in 3 rd Ventrikels oder kleine Embryonen (rechts). (B) Schematische Darstellung der electrporation durch Platin Stabelektrode (links) und Nadel Elektrode (rechts). Abbildung 3. Entwickeln Maus Telencephalon wurde mit pCAG-EYFP bei E13.5 (A), E14.5 (B) und E15.5 (C) elektroporiert und geerntet P6. Die Gehirne wurden geschnitten koronalen und gefärbt mit GFP-Antikörper oder Antikörper RORC getrennt und Bilder zusammengeführt werden. (A) Elektroporation von pCAG-EYFP Plasmid bei E13.5 transfizieren vielen Schicht 4 Neuronen. die Überschneidung mit Schicht 4 Marker RORC. (B) Elektroporation von pCAG-EYFP Plasmid bei E14.5 Transfektion von Zellen, die mehr oberflächlich als Schicht 4 Neuronen. (C) E15.5 Elektroporation label viele oberflächliche Neuronen wie Layer 2 / 3. Maßstabsbalken 200 um. Abbildung 4. Transfektion von EYFP in thalamo-kortikalen Axone (TCA). (A) TCA Endstation in kortikalen Schicht 4 wird durch GFP-Antikörper-Färbung zeigte. RORC Antikörper-Färbung wird verwendet, um eine Position der Schicht 4 zu enthüllen. Beide Bilder stammen aus demselben Abschnitt übernommen und zusammengeführt. (B) Position der Elektroporation in den Thalamus wird auch von GFP Antikörper-Färbung und RORC Färbung, die ihren Ausdruck in den Thalamus 11 begrenzt wird angezeigt. (C) Cartoon Schaltplan für thalamischen Elektroporation und TCA-Projektion gezeigt. Maßstabsbalken 200 um.