의 냄새-evoked 응답의 칼슘 이미징 Drosophila Antennal 엽

1. 마운팅 블록 어셈블리 플렉시 글라스 장착 블록 (그림 1A)을 (에서 제공하는 청사진에 주어진 정확한 사양에 제출하여야한다 http://neuro.uni-konstanz.de/j ove_mountingblock_blueprint / ) 파리 쉽게 장착과 절개를 허용합니다. 뒤쪽에서 나사를 통해 스레드하지만 블록의 전면 넘어 그들을 연장하지 않으며 그들의 위치는 (2.7 참조​​) 동물의 준비 기간 동안 조정됩니다. 정밀 드릴 사용하면,이 시점에서 블록의 두께를 줄이고, 파리의 시체를위한 공간을 만들기 위해 표면 아래 파고, 파리에 대한 원형 챔버의 위쪽 테두리의 발전을합니다. 메스 직각으로 구리 격자를 잘라 "칼라"를 만들기 위해 슬릿의 하단으로 닫습니다. 이것은 파리의 삽입을하는 데 도움이되므로 두 가지 결과로 펄럭는 레벨 있는지 확인합니다. 이쑤시개로 플라이를위한 순환 챔버 위의 마운팅 블록쪽으로 superglue의 작은 방울을 넣으십시오. 슬릿이 블록 (그림 1A)를 중심으로되도록 접착제와 위치를 향해 구리 그리드를 배치합니다. 부드럽게 아래로 눌러 초과 접착제를 제거하십시오. 족집게 한 켤레로, 각 측면에 펄럭 아래 접착제의 작은 방울을 추가하고 슬릿 바로 아래쪽 포인팅되도록 블록의 앞면 위에 격자를 접으십시오. 그리드의 맨 위에는 블록과 수준에 있는지 확인하십시오. 완전히 건조하도록 허용합니다. 전선 홀더 조립 : 하프 플라스틱 coverslip을 생략하고 "U"모양을 만들기 위해 중앙 조각을 제거합니다. "U"의 맨 위에 접착제 철사 한 조각으로 밀랍을 사용하여, 와이어가 너무 긴장하지 않습니다. antennal 방어막을 구축 : 종이 구멍 펀치와 플라스틱 coverslip에 구멍을 확인하십시오. 0.5 X 0.7 cm로 coverslip의 가장자리를 트림. 접착제 후 피어싱 플라스틱 끈적끈적한 테이프로 coverslip하고 구멍을 통해 노출된 테이프에 대한 에탄올의 방울을 배치접착제를 제거합니다. 2. 동물 준비 해당 유전자형의 파리 – 즉, "드라이버"와 활동 기자 transgenes의 원하는 조합을 베어링 – 1~3주 이전이어야합니다; 젊은 파리의 표피 컷이 너무 부드럽고 어렵습니다. 실험, 그리고 transgene 표현 수준을 일치하기 위해 여러 genotypes의 직접적인 비교가 필요하면, 파리는 연령과 관련된 생리적 차이를 피하기 위해 나이와 일치해야합니다. 성별은 중요하지 않다면, 우리는 그들이 더 큰 머리를 가지고 있고 조작하기 쉬운이기 때문에 여성의 파리를 사용하는 것을 선호합니다. 얼음에 냉각에 의해 파리를 마취. 마운팅 블록에 단일 플라이를 소개합니다. 날개 공동으로 파리를 잡고 밀어, 구리 격자의 슬릿을 따라 첫번째 지느러미 – 표면, 그것은 그것의 목 (그림 1B-C)에 의해 정지되어 있도록. 필요한 경우는 아래를 내려다 보면서 때까지 그것을 돌린다. F 앞에서 훌륭한 선인장 척추를 놓으십시오(그림 1B-C) 이스케이프하지 않도록 요의 머리. 이동하지 않도록 코 앞에 선인장 척추를 놓습니다. 밀랍을 사용하여 블록 선인장 척추를 고정한다. 머리의 상단이 블록의 맨 위에있는 수준인지 확인합니다. 로진의 작은 방울 (에탄올에 용해)로 블록 플라이의 머리를 고정한다. humidified 상자에 블록을 놓고 약 1 시간 단단해에 로진하실 수 있습니다. 안테나와 머리 사이 cuticular 배 안에, 집게를 사용하여 홀더 (1.5 참조 왁스 – 사이드 아웃)에 와이어를 앞으로 antennal 접시를 뽑아 놓습니다. 밀랍으로 블록의 전면에 홀더를 고정한다. 블록에 내장된 나사를 사용하여 부드럽게 antennal 판과 머리 사이 공간을 만들어야 앞으로 와이어 홀더를 밀어. 중앙 위치에 구멍 파리의 머리의 맨 위에 antennal 실드를 (1.6 참조) 놓습니다. 장착 블록의 상단에 밀랍으로 수정합니다. 블레이드 – 스플리터, 세제곱 사용방어막에 대한 테이프의 타 작은 구멍은 안테나 뒤에 파리의 머리 표피를 노출. 구멍가 새는에서 준비를 방지하기 위해 눈을 넘어 확대해서는 안됩니다. 두 구성 요소 실리콘으로 테이프와 표피 사이에 구멍을 밀봉합니다. 파리의 머리 위로부터 초과 실리콘을 제거합니다. 한 방울을 배치 Drosophila 울리는의 머리에 (130 MM NaCl, 5 KCl 밀리미터, 2 밀리미터 MgCl 2, 2 MM CaCl 2, 36 MM 이당류, 5 밀리미터 HEPES, 산도 7.3) 염분. 안테나 완전히 건조 남아 있어야합니다 전혀 누수가 없는지 확인합니다. 사파이어 블레이드를 사용하여 표피에 구멍을 했네요. 첫째, 가볍게 직접 안테나 뒤에 cuticular 배를 따라 점수는 다음 뒷면에 눈을 따라와 ocelli 전역 했네요. 마지막으로, 득점 끄트머리로 표피의 조각을 접어 antennal 신경을 severing 피하기 위해 아래쪽에서 했네요. 조심스럽게 고급 핀셋으로 분비 및 호흡 관을 제거하십시오. Drosophila와 반복 린스 </em>를 둘러싼의, 머리에 큰 방울을 떠난다. 3. 냄새 자극 배달 악취 주사기가 : 총신 깊숙히 패드를 밀어 피펫 팁을 사용, 적절한 용매에 원하는대로 희석 분출 깨끗한 포셉 및 피펫 (필터 팁 사용) 악취의 20 μl로 2 ML 플라스틱 주사기로 셀룰로스 패드를 삽입 . 플러그 앤 캡 주사기가 필요 때까지. 적어도 3 개월 (혹은 더 자주 높은 휘발성 및 / 또는 자주 사용하는 악취의 경우) 신선한 냄새 dilutions도 미리 알고 있어야하고, 새로운 패드 단지 각각의 녹음 세션 전에 악취 주사기 준비되어야한다. 악취 농도가 가옥 수 있기 때문에보다 3 stimulations에 대한 악취 패드를 사용하지 마십시오. 사용자 정의 만든 olfactometer (그림 2) : 주 공기 흐름은 (1 L / 분) 테플론 튜빙 (0.4 mm 내경)를 통해 이동되며 상류 이러한 튜브의 출구, 보조 공기 흐름 (1 L / 분 27cm ) 추가됩니다. 두 공기 흐름은 멤브레인 펌프에 의해 생성하고있다유속은 두 개의 독립적인 유량계에 의해 규제됩니다. 주의가 필요하다 (예 : ~ 60 분의 1 이상) 이상 – 가습을 피하기 위해 복용해야지만 에어 스트림, 가스 세척 병의 물을 통과하여 humidified 될 수 있습니다. 보조 공기 흐름은 악취 주사기 또는 빈 주사기를 통해서 이동됩니다 : 주사기는 플런저를 피어싱 주사기 바늘 (1.2 mm 외경)를 통해 공기 흐름으로 연결됩니다. 밸브 컨트롤러 장치 (예 : 하버드 기기 VC6)를 통해 제어되는 세 방향 마그네틱 밸브는 깨끗한 공기와 악취 자극 사이를 전환하는 데 사용됩니다. 4. 생체내 이미징에 우리는 20x 수질 목표 (예 : 자이스 혈구 W "플랜 – 고차 색지움"20x / 1,0 M27 DIC) (그림 2)이 장착된 수직 형광 현미경 (예 : 똑바로 고정 무대 자이스 혈구 Axio 심사관의 D1)를 사용하여 여기에 이​​미징에 대해 설명합니다. G-CAMP (여기 / 방출 : 509분의 488 nm의)와 영상 내용 : 450-490 나노미터 여기 필터, 다음과 같은 특성을 가진 필터 블록을 사용, 이색성 거울 (T495LP) 및 500-550 nm의 방사 필터 (채도 동부 표준시). 현미경 플라이를 포함하는 마운팅 블록을 배치합니다. 파리의 안테나 앞 olfactometer 약 0.5 cm의 출구를 둡니다. 그것은 파리의 머리에 울리는의 솔루션을 감동까지 목적을 낮춥니다. 머리 캡슐의 구멍은 중심과 국경 초점에되도록 밝은 – 그라운드 조명 하에서, 위치 준비를 뷰어를 통해 찾고. 당신이 표시된 뉴런을 (G-CAMP의 기저 녹색 형광의 명백한)을 볼 수까지 형광등으로 전환하고 초점을 조정합니다. 전하 결합 장치와 이미지를 인수하여 관심 glomeruli에 파인 초점 (CCD) 카메라 (예 : CoolSNAP-HQ2 디지털 카메라 시스템) 적절한 수집 소프트웨어 (예 : Metafluor) (그림 3A)를 사용하는 현미경에 장착. 몇 군데 지역에 여기 광을 제한하기 위해 조명 광 경로에 격막을 닫습니다. 냄새 evoked 녹음활동 4 Hz에서로 획득 률을 설정하고 CCD 카메라의 동적 범위 내에서 형광 값을 얻을 노출 시간을 조절하지만, 적어도 12 비트 다이나믹 해상도 1000 (임의 단위)보다 낮은 않습니다. 노출 시간은 G-캠프 photobleaching을 줄이기 위해 가능하면, 100 MS를 초과해서는 안됩니다. 카메라의 공간적 해상도가 허용하는 경우에는 노출 시간을 줄이기 위해 (한 디지털 픽셀로 binned됩니다 칩 우물의 수) binning을 높일 수 있습니다. 우리는 준비에서 210×135 μm의에 해당하는 350×225 픽셀 (2×2의 binning과)의 이미지를 구하십시오. 이러한 설정은 표백 기자를 제한하면서 좋은 공간과 시간적 해상도로 G-CAMP의 사구체 악취 유발 응답을 캡처할 최적입니다. 측정 매개 변수를 설정합니다. 우리는 일반적으로 악취 자극 일반적으로 인수 기간의 시작 후에 사초를 시작 (프레임 15) 지속적인 일초 (U로, 10 초 (즉, 40 프레임)에 대한 기록ntil 프레임 19). 플라이 준비는 보통 흔히 photobleaching으로 인해 기자의 형광 신호에 돌이킬 수 감소에 의해 제한 25-30 다른 악취 자극에 함께 테스트할 수 있습니다. 상호 자극 간격은 관찰 응답의 강도와 photobleaching의 속도에 따라 달라집니다. 감각 적응을 피하기 위해 상호 자극 간격의 적절한 길이를 시범 실험에서 긍정적인 제어 냄새 (알려진 경우)의 반복적인 프레 젠 테이션에 의해 약 확인할 수 있습니다. 이 냄새의 포함은 주어진 일련의 모든 ~ 10 자극의 지속적인 생존 능력과 준비의 일관된 반응의 확인을 허용할 수 있습니다. 5. 데이터 처리 및 분석 데이터는 ImageJ (맥 biophotonics 플러그인과 함께 사용하여 처리 www.macbiophotonics.ca )와 다음과 같이 Matlab 및 R에서 사용자 지정 작성된 프로그램 : 샘플 운동 구조물에 정정 :StackReg / TurboReg의 "단단한 몸"모드 (사용하는 늑대가 준비 (예 : 40 프레임 각각의 30 측정)에 해당하는 모든 이미지 정렬 bigwww.epfl.ch / thevenaz / stackreg ImageJ에이). 이 단계는 측정 이내 사이의 인수 프레임에 관하여 레이블 뉴런의 위치에 변화를 제거하는 데 필요합니다. 그러나, XY 평면의 변화을 없애야 가능합니다. 초점의 강력한 변화가 발생할 경우 데이터는 폐기되어야합니다. 개별 (40 프레임) 10 초 측정에 세그먼트 스택을. 유물 표백을위한 올바른 : 형광등 불빛에 노출은 하나의 측정 10시 가옥하는 형광하게됩니다. 어떤 경우에는 그것은 데이터를 분석하기 전에이 부패에 대한 정정하는 것이 중요합니다. 각 측정 배경 프레임을 계산합니다. 이것은 자극 증상 (예 : 프레임 6-14) 이전에 여러 프레임의 평균 있어야합니다. 이 backg하여 각 프레임 나누기상대 형광 변화를 얻기 위해 프레임을 높이 들어라. G-CAMP에 의해 표시된 영역 내의 모든 픽셀을 평균하여 각 프레임에 대한 평균 상대 형광 값을 계산합니다. 악취 응답 (20 프레임의 경우 자극 증상 이후)의 시간 부양과 제로 체중 전에 프레임에 강한 무게를 준다 평균 형광 커브에 두 지수를 장착. 각 픽셀의 상대 형광 곡선에서 장착되어 커브를 뺍니다. 원시 데이터를 다시 얻을 배경 프레임에 의해 수정된 프레임을 곱하면됩니다. 신호 측정의 끝 (억제 또는 아주 강한 흥분성의 응답 evoked하는 경우 예) (그림 4)에 의해 기준에 반환하지 않는 경우 정정의 이러한 종류의 응답 역학의 변형을 초래할 수 있습니다. 표백 유물의 수정이 많은 경우에 유용하지만 표백 정정이 적용되는 경우, 시간적 매개 변수의 해석은주의하여야한다. 형광의 상대적인 변화를 (& 드 계산lta, F / F) (각 측정의 각 프레임에 대한 F, I, F 0) / F F 0의 I 번째 프레임에 대한 나도 형광 값 배경 프레임 (5.3 참조), 그리고 F는 0 * 100, 측정. 활동 흔적 (그림 5A)을 구하는 10 개의 픽셀의 직경 glomerulus (그림 3B)에 대한 관심의 원형 지역 내의 평균 ΔF / F를 계산합니다. 원하는 경우 ImageJ를 (그림 5A)를 사용 heatmaps로 이들 성분을 변형. 응답의 피크시 평균 ΔF / 네 프레임의 F에서 자극 전 평균 ΔF / 네 프레임 F를 빼는 방법으로 응답의 피크 진폭을 계산합니다. 동일한 절차는 공간적 응답 패턴을 (그림 3B 참조) 설명하고 (그림 5B 참조) 파리 전역의 관​​심을 특정 지역에서 응답 진폭을 계량하는 데 모두 사용됩니다. 피크 응답도 자극 시간, 또는 averagin 동안 곡선 아래의 영역을 통합하여 계량하실 수 있습니다응답의 최대 주변 G는 프레임. 6. 대표 결과 우리는 OSNs 29,30 여러 가지 인구 (년 활성 후각 공동 수용체 IR8a을 위해 발기인의 통제하에 G-CaMP1.6 28 표현 파리 프로피 온산-evoked 응답을 기록하고 분석할 위의 프로토콜을 사용 피규어 3-5). 1퍼센트 프로피 온산과 자극은 G-캠프 형광의 증가를 elicits – 세포 내 칼슘의 증가를 나타내는 – 두 glomeruli, DC4 및 DP1l (그림 3B)를 innervating OSNs에. 온라인 활동을 추적, heatmaps 및 피크 반응 바 줄거리 : 우리는 그림 5에서 여러 파리에서 데이터를 표현하는 다양한 방법을 설명합니다. 프로피 온산-evoked 응답 DC4와 DP1l의 뚜렷한 피크 amplitudes와 현세의 역학 있습니다. 반응은 일반적으로 강력한 있지만 또한, 개별 동물 사이의 다양성도 (자신을 볼 glomeruli 모두에서 볼 수 있습니다그림 5A에서 atmaps). 정상 반응 (그림 5B)의 부량은 동물 전반에 걸쳐 다양한 glomeruli하고 다른 odorants 간의 간단한 통계적 비교를하실 수 있습니다. 그러나, 냄새 evoked 칼슘 반응은 비 균일 현세의 역학을 가질 수 있으며 하나의 값으로 자신의 진도를 quantifying하면이 복잡성을 무시합니다. 그림 1. 마운팅 블록의 도식 파리의 도입, 그리고 클로즈업의 (C) 상단보기 (31에서 적응) () 이전 (B) 후. 그림 2. 실험 설정의 도식. 그림 3. 단계 2.8 (왼쪽 패널)와 앤티의 원료 형광 이미지 후에 플라이 준비 () 톱보기nnal 엽 (叶)은 G-CaMP1.6 (; : G-CaMP1.6 : IR8a업자 UAS GAL4 유전자형)으로 표시. DC4와 DP1l glomeruli는 각각 그들의 형태, 크기와 위치에 의해 구분할 수 있으며, 빨간색과 파란색으로 표시됩니다. 프로피 온산 (1 % V / V)에 대한 응답의 (B) 색상 코딩된 이미지입니다. 이미지는 (또한 그림 5A 참조) 단계 5.6에 설명된대로 계산 응답의 피크의 ΔF / F에 해당합니다. 왼쪽 colorscale는 %의 ΔF / F 값을 나타냅니다. 검은 동그라미는 (그림 5 참조) 응답을 계량하는 데 관심있는 지역의 위치와 크기를 나타냅니다. 그림 4. 형광 기자 신호의 표백 수정. 5.3 단계에서 설명한대로 표백제 보정의 효과의 예. 왼쪽 패널에있는 샘플 데이터는 응답의 형태의 주요 변경없이 수정하실 수 있습니다. 오른쪽 패널에있는 샘플 데이터는 심각하게 영향을 미치지 않습니다가능성 표백제 보정에 의한 에드 신호가 떨어지고 냄새 자극 종료 후 기준 이하로 유지되기 때문입니다. 그림 5 (A) 탑 :. glomeruli DC4 (왼쪽)와 DP1l (오른쪽) 프로피 온산 (1 % V / V)에의 칼슘 반응의 시간적 역학. 검은 흔적은 8 동물에 걸쳐 관심 영역 (그림 3B 참조) 내에서 평균 ΔF / F의 평균을 보여줍니다. 회색 표면은 배포판의 첫번째와 세번째 quartiles 사이의 범위를 나타냅니다. 중앙 분리대 및 quartile 가치 프레 젠 테이션은 평균과 표준 에러보다 다양성과 관찰된 응답의 분포에 대한 자세한 정보를 제공합니다. 녹색과 마젠타 박스는 프레임이 그림 3B에 표시하고, 그림 5B 논리적으로 양이 정상 응답을 계산하기 위해 평균 나타냅니다. 하단 : heatmaps은 ΔF / F 값을 repr과 함께 별도의 행에있는 모든 개별 동물에 대한 응답 데이터를 표시colorscale (맨 오른쪽)에 의해 esented. 수평 검은 막대가 자극의 시간과 기간을 나타냅니다. (B) DC4와 DP1l glomeruli위한 8 개의 동물에 걸쳐 프로피 온산에 언 피크 반응. 오차 막대는 배포판의 첫번째와 세번째 quartiles 사이의 범위를 나타냅니다.