Undersöka Yttre Motility Hår Cell med en kombination av yttre Alternerande elektriska fältet stimulering och hög hastighet bildanalys
Summary
En tillförlitlig metod för att undersöka yttre hårceller (OHC) rörliga svar, inklusive electromotility, långsam motilitet och bockning, beskrivs. OHC motilitet utlöses genom stimulering med en extern växlande elektriskt fält, och metoden drar fördel av hög hastighet bild inspelning, LED-baserad belysning, och sista generationen bildanalys programvara.
Abstract
OHCs är cylindriska sensomotoriska celler som finns i organ Corti, det auditiva orgeln inuti däggdjur innerörat. Namnet "hårcellerna" härstammar från deras karakteristiska apikala bunt av sinneshår ett kritiskt element för att upptäcka och transduktion av ljud energi 1. OHCs kan ändra form-elongate, förkorta och böj-som svar på elektriska, mekaniska och kemiska stimulering, anses vara en motor respons avgörande för cochlea förstärkning av akustiska signaler 2.
OHC stimulering framkallar två olika rörliga svar: i) electromotility, alias snabba rörlighet, förändringar i längd i mikrosekunder intervallet från eldrivna konformationsändringar i motorproteiner tätt packade i OHC plasmamembran, och ii) långsamma motilitet, form förändringar i millisekund till sekunder utbud med cytoskelettala omorganisation 2, 3. OHC bockning förknippas med electromotility och resultera antingen från en asymmetrisk fördelning av motor proteiner i sidled plasmamembranet, eller asymmetrisk elektrisk stimulering av dessa motorproteiner (t.ex. med ett elektriskt fält vinkelrätt mot den långa axeln av cellerna) 4. Mekaniska och kemiska stimuli framkalla huvudsak långsamma rörliga svar, även om förändringar i den joniska villkor av cellerna och / eller deras omgivning också kan stimulera plasmamembranet-inbäddade motorproteiner 5, 6. Sedan OHC rörliga svar är en viktig del av Cochlear förstärkaren, den kvalitativa och kvantitativa analysen av dessa rörliga svaren på akustiska frekvenser (ungefär från 20 Hz till 20 kHz i människor) är en mycket viktig fråga inom området hörsel forskning 7.
Utvecklingen av ny bildteknik som kombinerar hög hastighet Videokameror, LED-baserade system belysning, och sofistikerad bildanalys programvara ger nu möjlighet att göra tillförlitliga kvalitativa och kvantitativa studier av rörliga svar av isolerade OHCs till en extern alternerande elektriskt fält (EAEF) 8. Detta är en enkel och icke-invasiv teknik som kringgår de flesta av de begränsningar som tidigare metoder 9-11. Dessutom ger LED-baserad belysning systemet extrem ljusstyrka med obetydliga termiska effekter på prover och, på grund av användningen av video mikroskopi, är optisk upplösning på minst 10-faldigt högre än med konventionell ljusmikroskopi tekniker 12. Till exempel med experimentuppställning beskrivs här, kan förändringar i cellernas längd av ca 20 nm rutinmässigt och tillförlitligt upptäcks vid frekvenser på 10 kHz, och denna resolution kan förbättras ytterligare vid lägre frekvenser.
Vi är övertygade om att detta experiment bidrar det till att utöka vår förståelse av de cellulära och molekylära mekanismerna bakom OHC motilitet.
Protocol
Discussion
Den experimentella metoden som presenteras här kan uppskatta OHC rörliga svar i kHz intervall utan några begränsningar till cellens rörelse. Olika stimuleringsprotokoll, extra markörer (mikrosfärer), liksom förändringar i inriktningen av cellen med hänsyn till det elektriska fältet, gör det möjligt att undersöka nya aspekter av OHC motilitet med en detaljnivå som tidigare otillgängliga. Andra metoder, t.ex. de som använder fotodioder 9 eller laser Doppler vibrometry 10, kräver en …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Arbetet stöds av National Institutes of Health bidrag R01DC10146/R01DC010397, NIDCD P30 DC006276 Forskning Core och högskolan. Dess innehåll är ensamt ansvarig för författare och representerar inte nödvändigtvis officiella ståndpunkter NIH eller högskolan. Författarna förklarar ingen befintlig eller potentiell intressekonflikt.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
| Leibovitz’s L-15 | Gibco | 21083 | |
| Collagenase (Type 4) | Sigma-Aldrich | C5138 | 1mg/mL in L-15 |
References
- Frolenkov, G. I. Genetic insights into the morphogenesis of inner ear hair cells. Nat Rev Genet. 5, 489-498 (2004).
- Ashmore, J. Cochlear outer hair cell motility. Physiol Rev. 88, 173-210 (2008).
- Dallos, P., Fakler, B. Prestin, a new type of motor protein. Nature Rev. Mol. Cell Biol. 3, 104-111 (2002).
- Frolenkov, G. I. Cochlear outer hair cell bending in an external electrical field. Biophys. J. 73, 1665-1672 (1997).
- Matsumoto, N., Kalinec, F. Extraction of Prestin-Dependent and Prestin-Independent Components from Complex Motile Responses in Guinea Pig Outer Hair Cells. Biophys J. 89, 4343-4351 (2005).
- Matsumoto, N., Kalinec, F. Prestin-dependent and prestin-independent motility of guinea pig outer hair cells. Hear Res. 208, 1-12 (2005).
- Ashmore, J. The remarkable cochlear amplifier. Hear Res. 266, 1-17 (2010).
- Kitani, R., Kakehata, S., Kalinec, F. Motile responses of cochlear outer hair cells stimulated with an alternating electrical field. Hearing Research. , (2011).
- Dallos, P., Evans, B. N. High-frequency outer hair cell motility: corrections and addendum. Science. 268, 1420-1421 (1995).
- Frank, G., Hemmert, W., Gummer, A. W. Limiting dynamics of high-frequency electromechanical transduction in outer hair cells. Proc. Natl. Acad. Sci. 96, 4420-4425 (1999).
- Santos-Sacchi, J. On the frequency limit and phase of outer hair cell motility: effects of the membrane filter. J. Neurosci. 12, 1906-1916 (1992).
- Inoué, S. . Video Microscopy. , (1986).
