Casting cerebrovascolare del topo adulto per l'imaging 3D e analisi morfologica

1. Compensazione del sangue da vasi Anestetizzare topo mediante iniezione intraperitoneale di 100 mg / kg di ketamina con 10 mg / kg xylazina diluiti in soluzione salina 0,25 ml. Una volta che l'anestesia è stata confermata da alcuna risposta a un pizzico zampa, usare le forbici per fare un'incisione sul petto con le forbici appena sotto il processo xifoideo, tagliare diaframma, e tagliare tra il segmento dorsale e ventrale della gabbia toracica per esporre cavità toracica. Esporre cuore piegando fino allo sterno e della parete toracica adiacente e sicuro con hemostat. Aprire il sacco pericardico con le pinzette per esporre il cuore. Accendere la pompa perfusione (100 mmHg di pressione) collegato al caldo PBS addizionato con eparina (5 unità / ml), soluzione in bagno di acqua calda a 37 ° C e il tubo con un brusco 22 gauge sul deflusso. Inserire l'ago nel ventricolo sinistro, vicino all'apice del cuore. Immediatamente taglio aperto l'atrio destro per permettere deflusso arteriosa sistemica e continuare a sciacquare fino a sangue is ritirate dalla circolazione. 2. Perfusione di Casting Agent nel sistema vascolare Preparare Microfil (flusso Tech, Inc. Carver, MA), soluzione di fusione per protocollo del produttore: Mescolare 5 ml di diluente MV con 4 ml di composto MV filtrata. Aggiungere 450μl (5%) di catalizzatore (induritore MV). Tempo di soluzione di lavoro è di 20 minuti, ma miscelare al momento dell'uso per garantire la corretta viscosità. Prelevare fusione soluzione agente in una siringa da 10 ml, allegare un brusco ago di calibro 20 alla siringa e riempire l'ago con soluzione. Inserire l'ago nel ventricolo sinistro attraverso il foro stesso usato per il lavaggio del sangue. Fissare l'ago in posizione con pinza emostatica sul cuore. Iniettare agente soluzione di colata lentamente nel ventricolo sinistro di circa 3 ml / min. Pressione in eccesso può portare a errate flusso di agente di casting o di rottura serbatoio potenziale. Cercare i segni di perfusione di successo, tra cui: la visualizzazione del castcomunemente in commercio, vasi intestino e fegato, scolorimento distali degli arti, e il naso e scolorimento della lingua. Regolare di nuovo l'ago, se necessario, per raggiungere la perfusione corretta. 3. Raccolta ed elaborazione del tessuto Togliere il cervello e mettere in paraformaldeide 4% durante la notte a 4 ° C. Disidratare cervello mettendo da paraformaldeide direttamente in EtOH sempre più concentrata a temperatura ambiente: 25% EtOH, 1 giorno, 50% EtOH, 1 giorno, 75% EtOH, 1 giorno, 95% EtOH, 2 giorni e il 100% EtOH, 2 giorni . Chiarire tessuto cerebrale intorno ai vasi sanguigni immergendo il cervello perfuso in salicilato di metile per 2 giorni a temperatura ambiente. Vascolarizzazione di tutto il cervello unsectioned chiarito può essere ripreso con il cervello immerso in salicilato di metile sotto un microscopio da dissezione (Fig. 1) (MZFL microscopio Leica III, Leica Microsystems, Bannockburn, IL) o microscopio campo chiaro (Fig. 2) (Leica DM / LS, Leica Microsystems). Reclarificationpuò essere fatto se il tessuto non è completamente eliminato. Dal cervello salicilato di metile, il trasferimento, al 95% EtOH per 2 giorni, 100% EtOH per 2 giorni, e salicilato di metile per 2 giorni. 4. Micro-CT Imaging o istologica Application-Preparazione del tessuto Il cervello può essere ripreso con micro-CT subito dopo chiarimenti o dopo il re-idratazione (Fig. 4). Per preparare il tessuto cerebrale per l'analisi istologica, reidratare il cervello attraverso seriale EtOH diluito: 100% EtOH, 1 giorno, 95% EtOH, 1 giorno, 75% EtOH, 1 giorno, 50% EtOH, 2 giorni, il 25% EtOH, 2 giorni ; e conservare in PBS. Il cervello può essere quindi inclusi in paraffina utilizzando una procedura standard. 5. Rappresentante Risultati A seguito di fusione vascolare, la cerebrovasculature può essere visto macroscopicamente sulla superficie del cervello (Fig.1a). L'albero vascolare all'interno del parenchima può essere visualizzata precisa quanto segue (Fig. 1B). La struttura dettagliata vascolarepuò essere ripreso e analizzato al microscopio campo chiaro (Fig. 2), dissezione portata (Fig. 3), e con micro-TAC (Fig. 4). Utilizzando il microscopio chiaro, il sistema vascolare può essere vista a diversi piani focali senza sezionare il cervello (Fig. 2A), così come microvasi individuali a maggiore ingrandimento (Fig. 2B). In un ambito di dissezione, si può vedere l'intera struttura vascolare in un unico piano focale, permettendo una migliore visualizzazione della struttura tridimensionale della cerebrovasculature (Fig. 3). Le immagini scattate sotto un microscopio da dissezione può mostrare morfologia grande nave e vascolarizzazione intero cervello, ma mancano i dati riportati nelle immagini scattate con la microscopia brightfield (Fig. 2B). Questa tecnica ci ha permesso di individuare i pescherecci irregolari nel nostro modello sperimentale topo adulto BAVM 2. La Figura 5 mostra un esempio dei vasi stessi irregolari rilevate da micro-TAC (Fig. 5A) e microscopio a campo chiaro (Fig. 5B). Insieme, questi dati dimostrano che siamo in grado di analizzare tlo stesso campione con strumenti di imaging più dopo la fusione vascolare. Figura 1. Cervello di topo intero successivo getto vascolare. Prima (A) e dopo (B) chiarificazione con salicilato di metile solvente. Le navi possono essere chiaramente visualizzate sulla superficie del cervello (A) e nella procedura di chiarificazione parenchima seguente (B). Figura 2. Immagini al microscopio di Brightfield chiarito cerebrali vascolari fuso. Cervello può essere ripreso in diversi piani e livelli diversi di ingrandimento. Scale Bar 200μm (A) e 50 micron (B). Figura 3. Dissezione immagine al microscopio a 1x mostrando tutta topo adulto cerebrovasculature cervello da una vista dorsale. <img alt = "Figura 4" src = "/ files/ftp_upload/2958/2958fig4.jpg" /> Figura 4. Micro-CT scansione delle immagini del cervello stesso intero topo adulto mostrato in Figura 3 da una vista dorsale. Figura 5. Applicazione del metodo di fusione vascolare per rilevare una malformazione arterovenosa cerebrale. A) Micro-TAC del cervello fuso vascolare mostra regione allargata, irregolari AVM-come navi in ​​emisfero destro da una vista ventrale. Immagine ingrandita della regione (scatola bianca) viene mostrato sulla destra. B) Lo stesso vasi irregolari visualizzati al microscopio campo chiaro con ingrandimento 50x. Scala bar 50 micron.