Moulage cérébrovasculaire de la souris adulte pour l'imagerie 3D et l'analyse morphologique

1. Effacement de sang de vaisseaux sanguins Anesthetize la souris par injection intrapéritonéale de 100 mg / kg de kétamine à 10 mg / kg de xylazine dilué dans 0,25 ml de solution saline. Une fois l'anesthésie a été confirmée par aucune réponse à une pincée de patte, utiliser des ciseaux pour faire une incision sur la poitrine avec des ciseaux juste en dessous du processus xiphoïde, couper à travers le diaphragme, et couper entre le segment dorsale et ventrale de la cage thoracique pour exposer la cavité thoracique. Exposer coeur en repliant le sternum et la paroi thoracique adjacentes et sécurisé avec pince hémostatique. Ouvrez le sac péricardique avec des pincettes pour exposer le cœur. Tournez sur la pompe de perfusion (100 mmHg de pression) connecté à chaud PBS plus héparine (5 unités / ml) solution dans le bain d'eau chaude à 37 ° C et les tubes avec une aiguille de calibre 22 émoussée sur la sortie. Insérez l'aiguille dans le ventricule gauche, près de la pointe du cœur. Immédiatement à ciel ouvert l'oreillette droite afin de permettre des sorties artérielle systémique et continuer à rincer jusqu'à ce sang, jes retirés de la circulation. 2. Perfusion d'agent de casting dans le système vasculaire Préparer Microfil (Flow Tech, Inc Carver, MA) solution de moulage par protocole du fabricant: Mélangez 5 ml de diluant MV avec 4 ml de composé MV filtré. Ajouter 450μl (5%) de catalyseur (durcisseur MV). Temps de solution de travail est de 20 minutes, mais mélanger immédiatement avant l'emploi afin d'assurer une viscosité adéquate. Retirer coulée solution d'agent dans une seringue de 10 ml, joindre une aiguille de calibre 20 émoussée à la seringue et l'aiguille avec remplissez solution. Insérez l'aiguille dans le ventricule gauche par le même trou utilisée pour la chasse dans le sang. L'aiguille sécurisée en place avec pince hémostatique sur le cœur. Injecter la solution agent de casting lentement dans le ventricule gauche à environ 3 ml / min. Une pression excessive peut conduire à des flux incorrecte agent de casting ou de rupture de la cuve potentiels. Rechercher des signes de la perfusion de succès, notamment: la visualisation des suffragesl'agent d'ING dans le système vasculaire intestin et le foie, la décoloration membre distal, et le nez et décoloration de la langue. Réajustez aiguille si nécessaire pour atteindre une perfusion adéquate. 3. Collecte et traitement des tissus Retirez le cerveau et les placer dans du paraformaldéhyde 4% pendant une nuit à 4 ° C. Déshydrater du cerveau en plaçant des paraformaldéhyde directement dans EtOH en plus concentré à température ambiante: 25% EtOH, 1 jour, 50% EtOH, 1 jour, 75% EtOH, 1 jour, 95% EtOH, 2 jours, et 100% EtOH, 2 jours . Clarifier les tissus du cerveau autour des vaisseaux sanguins en immergeant le cerveau perfusé au salicylate de méthyle pendant 2 jours à température ambiante. Vascularisation du cerveau entier clarifié non scié peut être visualisé avec le cerveau plongé dans du salicylate de méthyle sous un microscope à dissection (fig. 1) (Leica III MZFL microscope Leica Microsystems, Bannockburn, IL) ou microscopie fond clair (fig. 2) (Leica DM / LS, Leica Microsystems). Reclarificationpeut être fait si le tissu n'est pas complètement effacée. Du salicylate de méthyle transfert de cerveau, d'EtOH à 95% pendant 2 jours, 100 EtOH% pendant 2 jours, et du salicylate de méthyle pendant 2 jours. 4. Micro-CT Imaging ou histologique des tissus Application-Préparation Le cerveau peut être imagée en utilisant des micro-CT directement après clarification ou après ré-hydratation (Fig. 4). Pour préparer les tissus du cerveau pour l'analyse histologique, réhydrater le cerveau par EtOH diluée série: 100% EtOH, 1 jour, 95% EtOH, 1 jour, 75% EtOH, 1 jour, 50% EtOH, 2 jours, 25% EtOH, 2 jours , et stocker dans le PBS. Le cerveau peut alors être inclus dans la paraffine en utilisant une procédure standard. 5. Les résultats représentatifs Après coulée vasculaire, l'cerebrovasculature peut être vu sur le macroscopiquement la surface du cerveau (Fig.1A). L'arbre vasculaire à l'intérieur du parenchyme peuvent être visualisées précisions suivantes (Fig. 1B). La structure détaillée vasculairespeuvent être visualisés et analysés au microscope fond clair (Fig. 2), la dissection étendue (fig. 3), et avec la micro-tomographie (fig. 4). En utilisant la microscopie en fond clair, la vascularisation peut être consulté à différents plans focaux, sans sectionner le cerveau (figure 2A), ainsi que microvaisseaux individu au plus fort grossissement (figure 2B). Sous un microscope à dissection, on peut voir toute la structure vasculaire dans un plan focal, permettant une meilleure visualisation de la structure tridimensionnelle de l'cerebrovasculature (Fig. 3). Les images prises sous un microscope à dissection peut présenter une morphologie grand navire et de la vascularisation du cerveau entier, mais il leur manque les détails montré sur les photos prises avec la microscopie fond clair (figure 2B). Cette technique nous a permis de détecter des vaisseaux irréguliers dans notre modèle expérimental chez la souris adulte BAVM 2. La figure 5 montre un exemple des mêmes vaisseaux irréguliers détectés par des micro-tomographie (figure 5A) et microscope à fond clair (Fig. 5B). Ensemble, ces données montre que nous pouvons analyser til même échantillon avec de multiples outils d'imagerie vasculaire après la coulée. Figure 1. Cerveau de souris entières suivantes coulée vasculaire. Avant (A) et après (B) la clarification au salicylate de méthyle solvant. Les navires peuvent être clairement visualisée sur la surface du cerveau (A) et dans la procédure du parenchyme précisions suivantes (B). Figure 2. Images de microscopie en fond clair d'clarifié le cerveau coulé vasculaire. Cerveau peuvent être imagées à différents plans et à des niveaux de grossissement différent. Échelle Barre 200μm (A) et 50 microns (B). Figure 3. Dissection image du microscope à 1x montrant toute cerebrovasculature cerveau adulte de souris à partir d'un point de vue dorsale. <img alt = "Figure 4" src = "/ files/ftp_upload/2958/2958fig4.jpg" /> Figure 4. Micro-CT scan image du même cerveau d'adulte de souris montre la figure 3 d'une vue dorsale. Figure 5. Application de la méthode coulée vasculaires pour détecter une malformation artério-veineuse cérébrale. A) Les micro-CT scan du cerveau coulé vasculaires montre région élargie, irrégulière, comme l'AVM-vaisseaux dans l'hémisphère droit d'une vue ventrale. Image agrandie de la région (boîte blanche) est montré sur la droite. B) Même vaisseaux irréguliers visualisés au microscope à un grossissement de 50x fond clair. La barre d'échelle 50 microns.