Hücre tipi siRNA teslimat için özel anti-HIV gp120 aptamers Geliştirme
Summary
Nanomole afinite ile HIV 1BA-L gp120 karşı çeşitli 2'-Fluoro RNA aptamers bir RNA kütüphanesi ile izole edilmiştir.<em> In vitro</em> SELEX prosedürü. Chimera yeni bir çift inhibitör fonksiyonu anti-gp120 aptamer-siRNA oluşturulur ve sistemik anti-HIV tedavisi için önemli bir söz gösterir.
Abstract
HIV enfeksiyonu küresel salgın antiretroviral ajanlar ile yeni sınıflar için acil bir ihtiyaç yarattı. Tamamlayıcı RNA transkript ekspresyonunu inhibe güçlü yeteneği küçük bir müdahale (si) RNA'lar, HIV dahil olmak üzere çeşitli hastalıklar için terapötikler yeni bir sınıf olarak istismar ediliyor. Birçok önceki raporlarda roman RNAi tabanlı anti-HIV/AIDS tedavi stratejileri önemli bir söz var olduğunu göstermiştir, ancak başarılı bir tedavi uygulaması ve siRNA'lar klinik çevirisi kilit bir engel verimli teslimat. Özellikle, RNAi temelli tedaviler güvenliği ve etkinliği göz önünde bulundurularak, belirli bir hücre popülasyonları ya da doku hedeflenen hücre içi siRNA teslim yaklaşımı geliştirmek için son derece cazip. HIV-1 gp120 proteini, HIV-1 yüzeyinde bir glikoprotein zarf, CD4 hücrelerinin viral giriş önemli bir rol oynar. HIV-1 giriş tetikler ve hücre füzyonu başlatır gp120 ve CD4 etkileşimi ilaç keşfi için klinik olarak anlamlı bir anti-viral bir strateji olarak onaylanmıştır.
Bu yazıda öncelikle 2'-F modifiye anti-HIV RNA aptamers gp120 seçimi ve kimlik tartışacağız. Geleneksel bir nitroselüloz filtre SELEX yöntemi kullanarak, nanomolar afinite ile birçok yeni aptamers rasgele 50 nt RNA kütüphanesi izole edilmiştir. Başarılı bir şekilde yüksek bir afinite ile bağlı türler elde etmek için, dikkatli bir seçim darlığı koşulları ayarlayarak kontrol edilir. Seçilen aptamers özellikle bağlamak ve hızlı bir şekilde HIV-1 zarf proteini eksprese eden hücrelerin içine içselleştirilmiş. Ayrıca, tek başına aptamers HIV-1 enfektivite nötralize eder. En iyi aptamer A-1 dayanarak, biz de chimera aptamer ve siRNA bölümlerini hem de sahip olduğu güçlü anti-HIV faaliyetlerinin bir roman çift inhibitör fonksiyonu anti-gp120 aptamer-siRNA oluşturun. Ayrıca, HIV-1 ile enfekte hücrelerin içine siRNA hücre türüne özgü bir teslimat için gp120 aptamer siRNA kimeralar kullanmaktadır. Chimera Bu ikili işlevi, bastırmak, HIV-1 enfeksiyonu çeşitli nükleik asit terapötik ajanlar (aptamer ve siRNA) birleştirerek, hastalar için son derece aktif antiretroviral tedavinin (HAART) başarısız aptamer siRNA kimeralar çekici bir terapötik adaylar için önemli bir potansiyel gösterir.
Protocol
Discussion
In vitro ve böylece hedef moleküller 8 için son derece özel, sıkı bağlantı sağlayarak, özel ve istikrarlı bir üç boyutlu şekiller varsayıyorum nükleik asitler gelişti Aptamers . Düşük nanomolar afinitesi ve hedeflerine aptamers nefis özgüllüğü, in vivo görüntüleme ve tedavi 9, teşhis için çok yönlü araçlar olun . Hedeflenen siRNA teslimat için aptamer teknolojinin gelişi ile şimdi siRNA'lar 10-12 reseptör aracılı endositoz apt…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Britta Hoehn, Guihua Sun, Harris Soifer ve Lisa Scherer yararlı tartışmalar için teşekkür ederiz. CHO-EE ve CHO-gp160 hücre: Bu çalışma, Ulusal Sağlık Enstitüsü, AIDS Araştırma ve Referans Reaktifi Programı, AIDS Bölümü, NIAID, NIH yoluyla elde edilen, Sağlık AI29329 ve aşağıdaki reaktifler JJR layık HL07470 National Institutes of hibe tarafından desteklenen doğrultusunda; pNL4-3 luc vektör; NIAID DAIDS, HIV-1 Bal gp120.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
|---|---|---|---|
| MF-Millipore membrane filter | Millipore | HAWP01300 | Pore size 0.45 μm |
| Swinnex Filter holder | Millipore | SX0001300 | 13 mm diameter |
| QIAquick Gel Extraction Kit | QIAGEN | 28706 | DNA purification |
| Microcon YM-30 column | Millipore | 42410 | RNA concentration |
| Bio-spin 30 column | Bio-Rad | 732-6250 | RNA purification |
| Taq PCR DNA polymerase | Sigma-Aldrich | D1806 | |
| ThermoScript RT-PCR system | Invitrogen | 11146-024 | |
| DuraScribe T7 transcription Kit | EpiCentre | DS010925 | |
| dNTP for PCR | Roche | 1 581 295 | |
| Ribonucleic acid, transfer from E.coli | Sigma-Aldrich | R1753 | tRNA competitor |
| HIV-1Ba-L gp120 protein | the AIDS Research and Reference Reagent Program | 4961 | Target protein |
| Silencer siRNA labeling kit – Cy3 | Ambion | 1632 | |
| Acid phenol/chloroform 5/1 solution (pH 4.5) | Ambion | AM9720 | |
| Chloroform/Isopropanol 24/1 solution | Sigma | C0549 | |
| Calf intestinal phosphatase (CIP) | New England BioLab | M0290L | |
| T4 polynucleotide kinase | New England BioLab | M0201L | |
| Glycogen | Roche | 10 901 393 001 | RNA precipitation |
| Gamma-P32-ATP | MP Biomedical | 013502002 | Radiactivity |
| 40% AccuGel 19:1 | National Diagnostics | EC-850 | |
| 10xTBE | National Diagnostics | EC-860 | |
| N,N,N,N’-Tetramethylethylenediamine (TMEMD) | Sigma-Aldrich | T9281 | |
| Ammonium persulfate (APS) | Sigma-Aldrich | A3678 | |
| L-methioine sulfoximine | Sigma-Aldrich | M5379-250 mg | |
| RPMI Media 1640 | Invitrogen | 11835-030 | |
| Sodium Bicarbonate solution, 7.5% w/v | Invitrogen | 25080-094 | |
| Minimum Essential Medium (MEM) (10) | Invitrogen | 11430-030 | |
| MEM non-essential amino acid (100) | Invitrogen | 11140-050 | |
| TA cloning kit with pCR 2.1 | Invitrogen | K2040-01 |
References
- Tuerk, C., Gold, L. Systematic evolution of ligands by exponential enrichment: RNA ligands to bacteriophage T4 DNA polymerase. Science. 249, 505-510 (1990).
- Ellington, A. D., Szostak, J. W. In vitro selection of RNA molecules that bind specific ligands. Nature. 346, 818-822 (1990).
- Robertson, D. L., Joyce, G. F. Selection in vitro of an RNA enzyme that specifically cleaves single-stranded DNA. Nature. 344, 467-468 (1990).
- Fitzwater, T., Polisky, B. A SELEX primer. Methods Enzymol. 267, 275-301 (1996).
- Weiss, C. D., White, J. M. Characterization of stable Chinese hamster ovary cells expressing wild-type, secreted, and glycosylphosphatidylinositol-anchored human immunodeficiency virus type 1 envelope glycoprotein. J Virol. 67, 7060-706 (1993).
- Vodicka, M. A. Indicator cell lines for detection of primary strains of human and simian immunodeficiency viruses. Virology. 233, 193-198> (1997).
- Zhou, J. Selection, characterization and application of new RNA HIV gp 120 aptamers for facile delivery of Dicer substrate siRNAs into HIV infected cells. Nucleic Acids Res. , (2009).
- Mayer, G. The chemical biology of aptamers. Angew Chem Int Ed Engl. 48, 2672-2689 (2009).
- Famulok, M., Hartig, J. S., Mayer, G. Functional aptamers and aptazymes in biotechnology, diagnostics, and therapy. Chem Rev. 107, 3715-3743 (2007).
- Chu, T. C., Twu, K. Y., Ellington, A. D., Levy, M. Aptamer mediated siRNA delivery. Nucleic Acids Res. 34, e73-e73 (2006).
- McNamara, J. O., 2nd, . Cell type-specific delivery of siRNAs with aptamer-siRNA chimeras. Nat Biotechnol. 24, 1005-1015 (2006).
- Dassie, J. P. Systemic administration of optimized aptamer-siRNA chimeras promotes regression of PSMA-expressing tumors. Nat Biotechnol. 27, 839-849 (2009).
- Zhou, J., Rossi, J. J. The therapeutic potential of cell-internalizing aptamers. Curr Top Med Chem. 9, 1144-1157 (2009).
- Zhou, J., Li, H., Li, S., Zaia, J., Rossi, J. J. Novel dual inhibitory function aptamer-siRNA delivery system for HIV-1 therapy. Mol Ther. 16, 1481-1489 (2008).
