생활 세포의 분자 Rotors의 형광 수명 이미징

FLIM 샘플 준비를위한 프로토콜 공촛점 또는 넓은 필드 강도 기반의 형광 현미경 분들 다를하지 않습니다. 데이터 수집은 즉 원시 데이터의 형광 수명을 추출, 데이터 분석의 주요 작업은 다음에 있습니다. 일단 이들이 취득되어, 데이터 해석은 가설을 확인하거나 위조하는 데 도움이됩니다. 1. 분자 rotors있는 염색법 세포 에 염료 약 1 밀리그램 / ML을 해소하여 주식 솔루션 (10 ML)를 준비 적절한 용매 (BODIPY-C 12 예 : 메탄올) 6,7 정확한 균형과 피펫을 사용하여. 스테인드있을 세포는 (우리의 경우 모델 암 세포주, HELA) ~ 80 % 합류하기 전까지 5 % CO 2 분위기로 37 ° C에서 인큐베이터에서 현미경을위한 coverslide의 아래쪽으로 multiwell 플레이트에 대한 재배 . 10 추가 – 재고 용액 20 μl를 다중 나르는에서 성장하는 살아있는 세포에Opti-MEM 배지 (GIBCO) 당 잘 6 – 잘 접시 4 개 ML에 난 플레이트 (50 SmartSlide 마이크로 인큐베이션 시스템 Wafergen). 이것은 잘에서 마이크로 어금니 염료 농도를 얻을. 염색법에 대해 10-45 분를위한 5 % CO 2 분위기로 37 ° C에서 인큐베이터로 멀티 잘 번호판을 반환합니다. 인큐베이터에서 multiwell 플레이트를 제거하고 여분의 염료를 제거하는 네 ML 광학적으로 투명 세포 배양 매체 (예 : Opti-MEM)와 세포에게 3-4 회 씻는다. 현미경 단계에 multiwell 판을 전송하고 필요에 따라 영상을위한 준비, 온도 컨트롤러 / 5 % CO 2 가스 유입구에 연결합니다. 2. 세포의 형광 분자 rotors의 FLIM 현미경 스테이지에 샘플을 넣고 전송 및 형광 세포를 확인하는 형광 이미지를 구하십시오. 설정 실험의 개략도는 그림에 표시됩니다. 1.Verify 그 위치 expe에서 형광 emanatescted (예 : 세포막, 세포질). 형광 방출 스펙트럼을 확보하고,이 경우에는 분자 로터의 스펙트럼 예상 염료이나 단백질의 있는지 확인합니다. 부정적인 컨트롤로, 이미지가 아닌 스테인드 샘플을하고 형광하지 않는 있는지 확인합니다. 이 단계가 FLIM 위해 특별히 필수는 아니지만, 그것은 일반적으로 좋은 습관이며, 예제는 당신이 그것이 무엇인지 확인하는 데 도움이 않습니다. FLIM 모드로 전환 -이 쉽게 형광 검출 빔 경로 (Leica TCS SP2 수집 제어 소프트웨어에서 "빔 경로 설정"패널에서 "외부 검출기"버튼)에서 거울을 이동하여 수행됩니다. 검출기에 도달으로부터 흥미로운 빛을 차단하는 적절한 형광 방출 필터는 형광 검출 beampath에 있어야합니다. 그림 1. AC를 사용하여 시간 도메인 FLIM위한 실험적 조치onfocal 레이저 현미경 스캐닝. 샘플을 검사하고 검출기 카운트 속도 (베커 & Hickl SPC 830 보드의 수집 제어 소프트웨어에 CFD 표시된 검은 막대)가 더 이상 레이저 반복 률의 약 1 % (이상 없다는 것을, FLIM 수집을 제어하는​​ 컴퓨터에, 확인 녹색 막대) SYNC 수집 제어 소프트웨어를 분류. 그렇다면 더미 업 변형된 형광 붕괴 곡선을 수집 피하기 위해, 레이저 빔 경로에 중성 농도 필터를 배치하여 예를 들어 레이저 여기 강도를 줄일 수 있습니다. 일반적으로 3-5 분 동안 FLIM 이미지를 취득 스캔을 중지하고 원시 데이터 (3D 데이터 공간 좌표를 x와 y로 구성된 '큐브'및 시간) 저장하십시오. 예를 TRI-2 14 상용 소프트웨어, 형광 강도 이미지를 표시하려면위한 형광 붕괴 분석 소프트웨어 패키지의 원시 데이터를 엽니다. 이것은 단순히 통합 형광 붕괴이며, 각각에서 형광 붕괴 곡선 아래의 영역을 말한다픽셀. 거기에 커서를 배치하여 일반적인 픽셀을 선택하고 해당 픽셀의 형광 붕괴를 검사. 피크 카운트가 100 이하이면 픽셀의 공간적 binning을 사용합니다. 인접 픽셀 (예 : 3×3 또는 5×5)의 카운트가 높은 피크 카운트 거기서 얻은 것입니다 그래야 중심 픽셀에 추가됩니다. 이것은 다음 단계에 대한 높은 통계의 정확도를 제공합니다. 또는 측정은 긴 획득 시간 (5 단계)에 대한 반복 수 있습니다. 30 – 50 분 들면, 약 10 배 이상의 최대 개수 (그리고 총 카운트)이 얻어, 그러나 이것은 너무 오래 멀리 있기 때문에 샘플의 움직임에 의한 유물, 현미경 드리프트, phototoxicity 및 도입의 위험성이 대부분 생물 학적 샘플 수집 시간입니다 photobleaching. 글로벌 픽셀 임계값 값 (픽셀의 부패가 장착되는 위에있는)을 선택하고 이미지를 하나의 지수 감쇠 발작을 적용합니다. 결과는 다음으로 인코딩되어 임계값 위의 각 픽셀에 대한 형광 수명을 듭니다색상. 각 픽셀은 적합의 결과로 유색 인종이야, 그리고 FLIM지도가 얻어진다. 다양한 픽셀의 감소 치 제곱 값 체크 – 1 주변 (및 최대 1.3까지) 잘 맞는 나타냅니다. 무작위 제로 주위에 배포해야 해당 residuals을 검사합니다. 형광 수명 히스토그램의 특정 형광의 수명은 형광 수명 자체에 비해 발생 빈도 플롯. 형광 수명 분포는 색상 범위로 맞는되는 색상 범위 등의 조정합니다. monoexponential 판단 주변 1 기의-제곱 값 (및 최대 1.3까지)를 양보하지 않으며, 제로로부터 residuals의 체계적인 편차가있다면,보다 정교한 모델이 필요합니다. 예를 들어, 탐사선이 적합도 하나 염료의 상대적인 양을 알려주지 사전 지수 요인이나 amplitudes을 낼 것입니다 인치있을 수 있습니다 두 개의 서로 다른 환경에 계좌로, 형광 붕괴로 이중 지수 모델을 맞추려고 시도 둘러 싸다, 표준 또는 기타. 양자 택일로, 뻗어 지수 함수는 형광 수명의 분포 계좌가 적절한 수 있습니다. 각 픽셀에 대한 형광 수명, 사전 지수 요인 및 수명 비율과 사전 지수 인자 비율에 대한 결과는 다음 컬러로 인코딩 할 수 있습니다. 각 픽셀은 가치에 따라 컬러이며, 형광 수명, 사전 지수 요인과 그 비율에 따라 명암이 얻어진다. 적합한를 나타내는 1 시경 (및 최대 1.3까지) – 다시 감소 치 제곱 값 (도 컬러 인코딩 및 이미지로 표시할 수 있음) 확인합니다. 무작위 제로 주위에 배포해야합니다 residuals을 검사합니다. 형광 평생 histograms 평균 형광 평생 가치를 쉽게 시각화, 그리고 형광 수명 분포에 대한 모든 이미지를 동반해야합니다. 3. 대표 결과 형광 자연 붕괴를 위해 측정메탄올 / 글리세린 섞어으로 점도를 증가시 형광 분자 로터는 그림에 표시됩니다. 2. 형광 붕괴는 monoexponential이며, 형광 수명은 점성 함수로 현저하게 다릅니다. 그것은 메탄올에 약 300 PS (점도 0.6 CP)에서 95 % 글리세롤 (점도 950 CP)의 3.4 NS로 증가합니다. BODIPY-C 그림 2. 형광 붕괴 프로필 다양한 점도의 메탄올 / 글리세린 섞어 12 6. 형광 수명의 로그 보정 줄거리는 τ 대 형광 분자 로터에 대한 점성 η는 그림에 표시됩니다. 3. 포스터 호프만 방정식 9 일까지 요구대로 그것은 직선이다 K 0 radiativ입니다전자 일정한 속도, 그리고 Z와 x는 0 <x <1, 상수입니다. 양측의 수율에서 모두 로그를 복용 x 어디는 직선의 기울기이다. 그림 3. 포스터 – 호프만 방정식에 따라 bodipy-c 12 수확량 직선에 대한 로그 형광 수명 대 점도의 줄거리 6. 분자 로터와 살아있는 세포의 배양에 이어 작은 반점이있는 염료 배포는 이미지에서 관찰된다. meso 치환 bodipy 색소를 incubated hela flim 이미지는 그림에 표시됩니다. 4. 이미지의 각 픽셀의 붕괴는 적절 하나의 지수 감쇠 모델을 이용하여 장착할 수 있습니다. <p class ="jove_content"> 그림 4. () 형광 강도 및 BODIPY-C 12 물들일 HELA 세포 (B) FLIM 이미지. 밝고 중단 지역은 다른 지역보다 짧은 수명을 나타냅니다. 이 짧은 liftime는 포스터 – 호프만 방정식에 의하면, puncta의 낮은 점도, 아마도 지질 방울에 해당합니다. 모든 픽셀에서 추출한 수명을하려함으로써, 우리는 그림과 같이 전체 이미지의 형광 수명 히스토그램을 구하십시오. 5. 그림 5. meso – 치환 BODIPY 분자 rotors 물들일 HELA 세포의 FLIM 이미지에서 형광 수명의 Histograms.