生細胞における分子ローターの蛍光寿命イメージング

FLIMのサンプル調製のためのプロトコルは、共焦点またはワイドフィールド強度ベースの蛍光顕微鏡とは異なりません。データ収集は、すなわち生データから蛍光寿命を抽出し、データ解析の主なタスクは続いています。一度これらが得られた、データの解釈は仮説を検証したり改ざんするのに役立ちます。 1。分子ローター染色細胞正確なバランスとピペットを用いて6,7の適切な溶媒（BODIPY-C 12例えばメタノール）中の染料の約1 mg / mlを溶解させたストック溶液（10 ml）を準備します。 染色された細胞は、（我々の場合のモデル癌細胞株、HeLa細胞）〜80％コンフルエントになるまで、5％CO 2雰囲気下で37℃インキュベーターでは、顕微鏡用coverslide下面にマルチウェルプレートに上に栽培されています。 10を追加 – マルチWELで成長し、生きた細胞にストック溶液20μlを6ウェルプレートのウェルあたりのOpti-MEM培地（GIBCO）を4 mlのLプレート（50 SmartSlideマイクロインキュベーションシステムWafergen）。これはよくマイクロモルの色素濃度が得られます。 染色のための10から45分間、5％CO 2雰囲気下で37℃インキュベーターにマルチウェルプレートを返します。 インキュベーターからマルチウェルプレートを取り外し、過剰な色素を除去するために4ミリリットル光学的に透明な細胞培養培地（例えばのOpti-MEM）で細胞を3〜4回​​洗浄する。 顕微鏡のステージにマルチウェルプレートを転送し、必要に応じて画像の準備のために、温度コントローラ/ 5％CO 2ガス入口に接続します。 2。細胞内の蛍光分子ローターのFLIM 顕微鏡ステージ上にサンプルを配置し、伝送および蛍光細胞を識別するための蛍光画像を取得します。実験のセットアップの模式図を図に示されています。 1.Verifyその場所EXPEから蛍光が放出さCTED（例えば、細胞膜、細胞質）。蛍光発光スペクトルを取得し、それがこのケースでは、染料やタンパク質の期待している分子ローターのスペクトルであることを確認します。陰性対照として、画像の非染色したサンプルを、それが蛍光を発するないことを確認してください。このステップはFLIMのために特別に必須ではありませんが、それは一般的に良い習慣であり、サンプルでは、​​それは考えるものであることを確認するのに役立ちます。 FLIMモードに切り替え – これは容易に蛍光検出光路（ライカTCS SP2取得制御ソフトウェアの "ビーム·パスの設定"パネルの "外部検波器"ボタン）のミラーを移動することによって達成されます。検出器に到達するから励起光を遮断するための適切な蛍光発光フィルタは、蛍光検出beampathでなければなりません。 図1 ACアダプタを使ってタイム·ドメインFLIMのための実験装置onfocalレーザー走査顕微鏡。 サンプルをスキャンし、検出器の計数率（ベッカー＆Hickl SPC 830ボードの取得制御ソフトウェアにCFDというラベルの付いた黒いバー）はこれ以上のレーザ繰り返し周波数の約1％（以上ではないこと、FLIMの取得を制御するコンピュータ上で、チェックSYNC取得制御ソフトウェアラベル緑のバー）。されている場合は、パイルアップ歪ん蛍光減衰曲線を収集を避けるために、レーザービームのパスに中立的な密度フィルタを置くことによって、例えば、レーザー励起強度を、減らすことができます。 通常3〜5分間、FLIMのイメージを取得し、スキャンを停止し、生データ（3次元データ空間座標xとyから成る "キューブ"、時間）を保存します。 蛍光強度イメージを表示するには、例のTRI-2 14または商用ソフトウェアでは、蛍光減衰解析ソフトウェア·パッケージ内の生データを開きます。これは単純に統合された蛍光減衰であり、それぞれには、蛍光減衰曲線下の面積、すなわちピクセル。 それの上にカーソルを置くことによって、典型的なピクセルを選択し、そのピクセルの蛍光減衰を調べてください。ピークカウントが100未満の場合、画素の空間ビニングを使用しています。隣接する画素（例えば、3×3または5×5の）のカウントが高いピークカウントがが得られるように、中央のピクセルに追加されます。これは、次のステップのために高い統計精度を提供します。また、測定は長い捕捉時間（ステップ5）のために繰り返される可能性があります。 30 50分のために、約10倍のピーク数（および合計数）が得られますが、これはためサンプルの動きに起因するアーチファクトを導入する危険性をはるかに多くの生物学的サンプルの収集時間が長すぎる、顕微鏡ドリフトされ、光毒性と退色。 グローバルピクセルのしきい値を（ピクセルで減衰が装着されている上記）を選択し、画像への単一の指数関数的減衰フィットを適用します。結果はその後でエンコードされているしきい値は、上記の各ピクセルの蛍光寿命が得られます色を指定します。各ピクセルは、フィットの結果で彩られ、FLIMマップが得られます。さまざまなピクセルの縮小カイ二乗値を確認します – 1（および​​最大1.3）の周りには良いフィット感を示しています。ランダムゼロの周りに分配されるべきである対応する残差を、点検してください。 特定の蛍光寿命は蛍光寿命自体に対し、発生する頻度を蛍光寿命のヒストグラムをプロットします。蛍光寿命分布は色の範囲に収まるように色の範囲を調整します。 monoexponentialフィットが約1のカイ二乗値（および最大1.3）を得ませんし、ゼロからの残差の系統的な偏差がある場合は、より洗練されたモデルが必要となります。たとえば、また一つに色素の相対量の指示を与える前の指数因子や振幅が得られますプローブはフィットインチかもしれない2つの異なる環境を考慮して、蛍光減衰に二重指数関数モデルを当てはめてみてください環境メンターや他の。また、延伸指数関数では、蛍光寿命の分布を説明するために適切であるかもしれません。 各ピクセルの蛍光寿命は、事前指数因子、および寿命比と前の指数係数比の結果は、カラーでエンコードすることができます。各ピクセルは、その値に応じて着色し、蛍光寿命、事前指数因子およびそれらの比に起因するコントラストが得られます。優れたフィット感を示しています約1（および​​最大1.3） – 再び、減少カイ二乗値（また、色でコード化され、画像として表示することができる）をチェックしてください。ランダムゼロの周りに分配されるべきである残差を、点検してください。 蛍光寿命のヒストグラムは、平均蛍光寿命の値を簡単に可視化するためのすべての画像、および蛍光寿命分布を伴うべきである。 3。代表的な結果を測定し、蛍光減衰メタノール/グリセロール混合物の粘度を増加させるに蛍光分子ロータは図に示されています。 2。蛍光減衰はmonoexponentialであり、蛍光寿命は、粘度の関数として著しく変化します。これは、メタノール中で約300ピコ秒（粘度0.6 CP）から95％グリセロール（粘度950 cP）の3.4 nsに増加します。 図2粘度を変化させたメタノール/グリセロール混合物のBODIPY-C 12の蛍光減衰のプロファイル6。 蛍光寿命の対数のキャリブレーションプロットはτ対蛍光分子ロータの粘度ηを図に示されています。 3。フェルスターホフマン式（9）で求められるように、それは直線です。 kは0 radiativですeの速度定数、 および zとxは 0 <x <1で、定数である。両側の利回りに対数をとる ここで、x は直線の勾配です。 bodipy-c 12収量フェルスター·ホフマン式に従って直線のログ蛍光寿命対ログ粘度の3プロット図 6。 蛍光分子ローターと生きている細胞のインキュベーションに続いて点状の色素の分布が蛍光画像で観察される。メソ置換bodipy色素と共にインキュベートしたhela細胞のflimイメージは図に示されています。 4。画像の各ピクセルの蛍光減衰が十分に単一の指数関数的減衰モデルを使用して取り付けることができます。 <p class="jove_content"> 図4（a）の蛍光強度とBODIPY-C 12で染色したHeLa細胞の（b）のFLIMの画像。明るい、強調する領域は、他の地域よりも短い寿命を示す。この短いliftimeはフェルスター·ホフマン式に従って、涙点の低い粘度は、おそらく脂質滴に対応しています。 図に示すように、すべてのピクセルから抽出された寿命をプロットすることにより、我々は、画像全体の蛍光寿命のヒストグラムを取得します。 5。 図5。メソ置換BODIPY分子ローターで染色したHeLa細胞のFLIM画像からの蛍光寿命のヒストグラム。