Флуоресценции жизни молекулярных роторов в живых клетках

Протоколы FLIM пробоподготовки не отличаются от тех, для конфокальной или широким поля на основе флуоресцентной микроскопии. Сбор данных следует основная задача анализа данных, то есть извлечение жизни флуоресценции от исходных данных. Как только они были получены, интерпретации данных позволяет проверить или фальсифицировать гипотез. 1. Окрашивание клеток молекулярных роторов Подготовка исходного раствора (10 мл) путем растворения примерно 1 мг / мл красителя в подходящем растворителе (например, метанол для BODIPY-C 12) 6,7 помощью точного баланса и пипетки. Клетки (клетки рака модель линии, HeLa в нашем случае), что окрашенные выращиваются на пластине в многоямного с нижней coverslide для микроскопии, в инкубаторе при температуре 37 ° C с 5% CO 2 атмосферы до ~ 80% сливной . Добавить 10 – 20 мкл исходного раствора в живые клетки, растущие в нескольких-вэйл пластины (SmartSlide 50 микро-инкубации системы, Wafergen) в 4 мл Opti-MEM среде (GIBCO) в каждую лунку по 6-луночного планшета. Это приводит к микро-молярные концентрации красителя в скважине. Вернуться в мульти-и пластины инкубатор при 37 ° С с 5% CO 2 атмосферы 10-45 минут для окрашивания. Снимите пластину многоямного из инкубатора и промыть клетки 3-4 раза с 4 мл прозрачное среду клеточной культуры (например, Opti-MEM), чтобы удалить лишнюю краску. Передача пластины многоямного на предметный столик микроскопа и подключаться к контроллеру температуры / 5% СО 2 газа на входе в случае необходимости, в рамках подготовки к визуализации. 2. FLIM люминесцентных молекулярных роторов, в клетках Поместите образец на предметный столик микроскопа и получения передач и флуоресценции изображений для определения флуоресцентных клеток. Схема экспериментальной установки показана на рис. 1.Verify, что флуоресценция исходит от места expeИДКТК (например, клеточной мембраны, цитоплазмы). Получить флуоресценции спектр излучения, и убедитесь, что это то, что на красителе или белка и ожидалось, в этом случае спектр молекулярных роторов. В качестве отрицательного контроля, изображение, не окрашенный образец и убедитесь, что она не светиться. Хотя этот шаг не является необходимым специально для FLIM, это хорошая практика в целом, и это поможет убедиться, что образец является то, что вы думаете. Переключитесь на режим FLIM – это легко сделать, перемещая зеркало из флуоресценции путь луча обнаружения ("внешний детектор" на "луча настройки" панели Leica TCS SP2 приобретение программного управления). Соответствующий флуоресцентный фильтр излучения, чтобы блокировать любые возбуждающего света от достижения детектор должен быть в флуоресценции beampath обнаружения. Рисунок 1. Экспериментальная установка для временной области FLIM с помощью сетевогоonfocal лазерного сканирующего микроскопа. Проверка образца и проверить, на компьютере управления FLIM приобретения, что скорость счета детектора (черная полоса помечены CFD на приобретение программного обеспечения управления в Беккера и Hickl SPC 830 платы) составляет не более 1% от частоты повторения лазер ( Зеленая полоса помечены SYNC приобретение программного обеспечения управления). Если это так, снизить интенсивность лазерного возбуждения, например, поставив фильтр нейтральной плотности на пути лазерного луча, чтобы избежать сбора нагромождение искаженных флуоресценции кривых затухания. Получить FLIM изображение, как правило, в течение 3-5 мин, остановить сканирование и сохранение исходных данных (3D-данных "куб", состоящий из пространственных координат х и у, и времени). Откройте исходные данные в флуоресценции пакет программного обеспечения для анализа распада, например TRI-2 14 или коммерческое программное обеспечение, чтобы отобразить изображение флуоресценции интенсивности. Это просто интегрированной флуоресценции, т.е. площадь под кривой затухания флуоресценции в каждойпиксель. Выберите типичный пикселей, поместив на нее курсор и проверить флуоресценции в том, что пиксел. Если пик количества ниже 100, использование пространственных биннинга пикселей. Пунктам соседних пикселей (например, 3×3 или 5×5) добавляется в центральное пикселей, так что более высокий пик количества получается там. Это обеспечивает более высокую статистическую точность для следующего шага. Кроме того, измерения можно повторить в течение длительного времени приобретения (шаг 5). В течение 30-50мин, примерно в 10 раз выше, пик количества (и общего счета) получается, но это слишком долго приобретения время для большинства биологических образцов в связи с опасностью введения артефактов из-за перемещения образца, микроскоп дрейф, и фототоксичности фотообесцвечивания. Выберите глобальной порогового значения пикселей (выше которого распада пикселя установлен) и применять единый экспоненциальный спад подходит к изображению. В результате получается флуоресценции для каждого пикселя выше порога, который затем кодируется вцвета. Каждый пиксель окрашен с результатом нужным, и FLIM карта получается. Проверьте снижение хи-квадрат значения для различных точек – около 1 (до 1.3) указывает на хорошую подгонку. Проверьте соответствующие остатки, которые должны быть случайным образом распределены вокруг нуля. Флуоресценции гистограмма участков, как часто определенные жизни флуоресценции происходит по отношению к флуоресценции себя. Настройка цветовой гаммы, что распределение флуоресценции жизни вписывается в цветовую гамму. Если monoexponential подходит не дает хи-квадрат стоимостью около 1 (до 1.3), и есть систематическое отклонение остатков от нуля, более сложные модели не требуется. Например, попробуйте установку двойной экспоненциальной модели флуоресценции распадов, на счет в течение двух различных средах зонд может быть дюйма подходит также дают предэкспоненциальный факторов или амплитуды, которые дают представление об относительной количество красителя в одном средаобращения или другой. Кроме того, растянутый экспоненциальной функции может быть полезно для учета распределения жизни флуоресценции. Результаты для жизни флуоресценции, предэкспоненциальный факторов, а жизнь и отношение предэкспоненты коэффициент для каждого пикселя может быть закодирована в цвете. Каждый пиксель окрашен в соответствии с его значением и контрастности благодаря флуоресценции жизни, предэкспоненциальный факторов и их соотношение получается. Опять же, проверить приведенные хи-квадрат значения (которые также могут быть закодированы в цвете и отображаются в виде изображения) – около 1 (до 1.3) указывает на хорошую подгонку. Осмотр остатков, которые должны быть случайным образом распределены вокруг нуля. Флуоресценции гистограммы жизни должно сопровождать все изображения для легкой визуализации среднего значения флуоресценции жизни, и распределение флуоресценции жизни. 3. Представитель Результаты Флуоресценции распадов измеренылюминесцентные молекулярной ротора при увеличении вязкости в метанол / глицерин смеси показана на рис. 2. Флуоресценции распадов monoexponential и флуоресценции заметно различается в зависимости от вязкости. Она увеличивается с около 300 пс в метаноле (вязкость 0,6 сП) до 3,4 нс в 95% глицерина (вязкость 950 сП). Рисунок 2. Флуоресценция профилей распада BODIPY-C 12 в метаноле / глицерин смеси различной вязкости 6. Логарифмическом калибровки флуоресценции τ по сравнению с вязкостью η для люминесцентных молекулярного ротора показаны на рис. 3. Он представляет собой прямую линию, как того требует уравнение Ферстер Хоффман 9 где А 0 radiativэлектронная константа скорости, и г и х постоянные, причем 0 <х <1. Логарифмируя с обеих сторон дает где х градиент прямой линии. Рисунок 3. Участка журнала флуоресценции вязкости против журнала для жизни BODIPY-C 12 дает прямой в соответствии с Ферстер-Гоффмана уравнений 6. После инкубации живых клеток с флуоресцентным молекулярного ротора точечной распределение красителя наблюдается в флуоресцентных изображений. FLIM изображений клеток HeLa инкубировали с мезо-замещенных краситель BODIPY показаны на рис. 4. Флуоресценции распадов в каждом пикселе изображения могут быть надлежащим образом установлены с помощью одного экспоненциальная модель распада. <p class="jove_content"> Рисунок 4. (А) и интенсивности флуоресценции (б) FLIM изображений клеток HeLa окрашивали BODIPY-C 12. Яркий, точечный регионов демонстрируют более короткий срок, чем в других регионах. Этот короткий liftime соответствует более низкой вязкостью в puncta, вероятно, липидные капли, в соответствии с Ферстер-Гоффмана уравнений. Построив жизни извлечены из каждого пикселя, получаем флуоресценции гистограмма жизни все изображение, как показано на рис. 5. Рисунок 5. Гистограммы жизни флуоресценции от FLIM изображений клеток HeLa окрашивали мезо-замещенных BODIPY молекулярных роторов.