Imagerie de vie de fluorescence des rotors moléculaires dans les cellules vivantes

Les protocoles de préparation des échantillons FLIM ne diffèrent pas de ceux pour confocale ou à champ large fondé sur l'intensité de microscopie par fluorescence. L'acquisition de données est suivie par la tâche principale de l'analyse des données, soit l'extraction des durées de vie de fluorescence à partir des données brutes. Une fois ceux-ci ont été obtenus, l'interprétation des données permet de vérifier ou de falsifier des hypothèses. 1. Cellules présentant une coloration avec des rotors moléculaires Préparer une solution mère (10 ml) en dissolvant environ 1 mg / ml du colorant dans un solvant approprié (par exemple le méthanol pour BODIPY-C 12) 6,7 en utilisant une balance de précision et d'une pipette. Les cellules d'une lignée cellulaire (modèle de cancer, HeLa, dans notre cas) pour être colorés sont cultivées dans une plaque multipuits avec un dessous coverslide pour la microscopie, dans un incubateur à 37 ° C avec une atmosphère de CO 2 5% jusqu'à ~ 80% de confluence . Ajouter 10 à 20 pl de la solution stock à des cellules vivantes en croissance dans un environnement multi-welplaque de l (SmartSlide 50 micro-incubation système, WaferGen) dans 4 ml de milieu Opti-MEM (GIBCO) par puits d'une plaque à 6 puits. Cela donne une concentration de colorant micro-molaire dans le puits. Retour de la plaque multi-puits dans un incubateur à 37 ° C avec une atmosphère de CO 2 5% pour les 10-45 minutes pour la coloration. Retirer la plaque multipuits de l'incubateur et laver les cellules 3-4 fois avec 4 ml milieu de culture cellulaire optiquement clair (par exemple Opti-MEM) pour enlever l'excédent de teinture. Transférer la plaque multipuits de la platine du microscope et se connecter à un contrôleur de température / 5% d'entrée de gaz CO 2, au besoin, dans la préparation pour l'imagerie. 2. FLIM des fluorescents rotors moléculaires dans les cellules Placer l'échantillon sur la platine du microscope et obtenir une image de fluorescence de transmission et pour identifier des cellules fluorescentes. Un schéma de principe du montage expérimental est représenté sur la figure. 1.Verify que les émane de fluorescence de l'expé endroitsDECT (par exemple la membrane cellulaire, le cytoplasme). Obtenir un spectre d'émission de fluorescence, et de vérifier qu'il est celle du colorant ou de la protéine prévu, dans ce cas le spectre du rotor moléculaire. Comme un contrôle négatif, l'image d'un échantillon non-teinté et vérifier qu'il ne montre aucune fluorescence. Bien que cette étape n'est pas essentielle spécifiquement pour FLIM, il est de bonne pratique en général et ne permettra de vérifier que l'échantillon est ce que vous pensez qu'elle est. Passez en mode FLIM – ceci est facilement accompli en déplaçant un miroir sur le trajet du faisceau de détection de fluorescence («externe détecteur" sur "chemin réglage du faisceau" panneau sur le logiciel Leica TCS SP2 de contrôle d'acquisition). Un filtre à l'émission de fluorescence appropriée pour bloquer toute lumière excitatrice d'atteindre le détecteur doit être dans le beampath détection par fluorescence. Figure 1. Dispositif expérimental pour le domaine temporel FLIM utilisant du courant alternatiflaser onfocal microscope à balayage. Numérisation de l'échantillon et de vérifier, sur l'ordinateur de contrôle de l'acquisition FLIM, que le taux de comptage de détecteur (barre noire marquée CFD sur les logiciels de contrôle d'acquisition de l'Becker & Hickl CPS 830 conseil d'administration) n'est pas supérieure à environ 1% du taux de répétition des impulsions laser ( barre verte marquée logiciel de synchronisation de contrôle d'acquisition). Si c'est le cas, de réduire l'intensité d'excitation laser, par exemple en plaçant un filtre de densité neutre dans la trajectoire du faisceau laser, afin d'éviter la collecte de pile-up déformées courbes de décroissance de fluorescence. Acquérir une image FLIM, généralement pendant 3-5 min, arrêter le balayage et enregistrer les données brutes (en 3D des données «cube» composé de coordonnées spatiales x et y, et le temps). Ouvrez les données brutes dans le progiciel désintégration analyse par fluorescence, par exemple TRI-2 14 ou d'un logiciel commercial, pour afficher l'image d'intensité de fluorescence. C'est tout simplement la désintégration de fluorescence intégré, c'est à dire l'aire sous la courbe de décroissance de la fluorescence, dans chaquepixel. Sélectionnez un pixel typique en plaçant le curseur sur elle, et d'inspecter l'décroissance de la fluorescence dans ce pixel. Si le nombre maximum est inférieur à 100, utilisez binning spatiale des pixels. Les chiffres de pixels adjacents (par exemple 3×3 ou 5×5), on ajoute dans le pixel central, de sorte qu'un nombre supérieur de crête est obtenu. Cela donne une plus grande précision statistique pour l'étape suivante. Sinon, la mesure pourrait être répétée pour un plus long temps d'acquisition (étape 5). Pour 30-50min, un décompte d'environ 10 fois plus élevé de pointe (et le compte total) est obtenu, mais cela est loin trop longtemps un temps d'acquisition pour la plupart des échantillons biologiques en raison du danger d'introduire des artefacts dus au mouvement de l'échantillon, la dérive du microscope, la phototoxicité et photoblanchiment. Sélectionnez une valeur de pixel mondiale de seuil (au-dessus duquel la désintégration d'un pixel est équipé) et d'appliquer un ajustement décroissance exponentielle simple à l'image. Le résultat donne une durée de vie de fluorescence pour chaque pixel au-dessus du seuil, qui est ensuite codées danscouleur. Chaque pixel est coloré avec le résultat de l'ajustement, et une carte FLIM est obtenu. Vérifiez les réduits du chi-carré des valeurs pour différents pixels – autour de 1 (et jusqu'à 1,3) indique un bon ajustement. Inspectez les résidus correspondants, ce qui devrait être répartis de façon aléatoire autour de zéro. Les parcelles de fluorescence histogramme vie combien de fois certains se produisent de vie de fluorescence par rapport à la durée de vie de fluorescence elle-même. Ajuster la gamme de couleurs de telle sorte que la distribution de vie de fluorescence s'insère dans la gamme de couleurs. Si un ajustement monoexponentielle ne donne pas une valeur du chi-carré de l'ordre de 1 (et jusqu'à 1.3), et il ya un écart systématique des résidus à partir de zéro, un modèle plus sophistiqué est nécessaire. Par exemple, essayez de monter un modèle à double exponentielle pour les déclins de fluorescence, pour tenir compte de deux environnements différents de la sonde peut être po L'ajustement permettra également d'obtenir des facteurs pré-exponentiels ou amplitudes qui donnent une indication de la quantité relative de colorant dans un environment ou l'autre. Alternativement, une fonction exponentielle étirée peut être approprié de tenir compte d'une répartition des durées de vie de fluorescence. Les résultats de la durée de vie de fluorescence, des pré-exponentielles facteurs, et le rapport durée de vie et le rapport facteur de pré-exponentielle pour chaque pixel peut être codé en couleur. Chaque pixel est coloré en fonction de sa valeur, et le contraste en raison de la durée de vie de fluorescence, pré-exponentiels des facteurs et de leurs rapports est obtenu. Encore une fois, vérifiez les réduits du chi-carré des valeurs (qui peuvent également être codées en couleur et affiché comme une image) – autour de 1 (et jusqu'à 1,3) indique un bon ajustement. Inspectez les résidus, ce qui devrait être répartis de façon aléatoire autour de zéro. Histogrammes de vie de fluorescence doit accompagner toutes les images pour une visualisation facile des valeurs moyennes de durée de vie de fluorescence, et la distribution de vie de fluorescence. 3. Les résultats représentatifs Déclins de fluorescence mesurée pourle rotor moléculaire fluorescent à augmenter la viscosité dans le méthanol / glycérol mélanges sont présentés dans la figure. 2. La désintégration de fluorescence sont monoexponentielle, et la durée de vie de fluorescence varie sensiblement en fonction de la viscosité. Elle augmente d'environ 300 ps dans le méthanol (viscosité 0,6 cP) à 3,4 ns dans le glycérol à 95% (viscosité 950 cP). Figure 2 profils. Décroissance de la fluorescence pour BODIPY-C 12 dans le méthanol / glycérol mélanges de viscosité variable. 6 La courbe d'étalonnage logarithmique de vie de fluorescence τ par rapport viscosité η pour le rotor moléculaire fluorescent est montré dans la figure. 3. Il s'agit d'une ligne droite comme exigé par l'équation Förster Hoffman 9 où k 0 est la radiativTaux constante e, et z et x sont des constantes, avec 0 <x <1. en prenant le logarithme des deux côtés sur les rendements où x est la pente de ligne droite. figure 3. une parcelle journal durée vie fluorescence vs log viscosité pour bodipy-c 12 donne droite établie conformément à l'équation förster-hoffmann. 6 après incubation cellules vivantes avec rotor moléculaire fluorescent distribution ponctuée colorant observé dans images fluorescence. flim hela incubées un méso-substituée bodipy sont montré fig. 4. déclins chaque pixel l'image peut être adéquatement équipés utilisant modèle décroissance exponentielle simple. <p class ="jove_content"> Figure 4. (A) L'intensité de fluorescence et les images FLIM (b) de cellules HeLa colorées avec BODIPY-C 12. Les régions lumineuses, ponctuées présentent une plus courte durée de vie que les autres régions. Cette plus courte liftime correspond à une viscosité plus faible dans le puncta, probablement gouttelettes lipidiques, conformément à l'équation Förster-Hoffmann. En traçant les durées de vie extraits de chaque pixel, on obtient un histogramme de vie de fluorescence de l'image tout tel que montré dans la figure. 5. Figure 5. Histogrammes des durées de vie de fluorescence à partir d'images FLIM de cellules HeLa colorées avec méso-substitués rotors BODIPY moléculaires.