在活细胞中的荧光寿命成像分子转子

没有什么不同强度的荧光显微镜聚焦或宽领域的FLIM的样品制备的协议。其次是数据采集，数据分析的主要任务，即从原始数据中提取的荧光寿命。一旦这些已经获得的数据的解释，有助于验证或伪造的假设。 1。染色细胞与分子转子准备股票液（10毫升）约1毫克/毫升的染料溶解在适当的溶剂（如甲醇肾上腺素-12）6,7用一个精确的平衡和吸管。 为的显微镜coverslide底面与被染色的细胞模型癌细胞线，在我们的例子中的HeLa生长在多孔板，在孵化器5％的CO 2气氛直到在37°C〜80％汇合。 添加10 – 20μl原液的活细胞生长在一个多-WEL升板（SmartSlide 50微孵化系统，Wafergen），4毫升的Opti-MEM培养基（GIBCO公司），每6孔板。这就产生了在良好的微摩尔染料浓度。 返回孵化器在37°C多孔板与5％的CO 2染色为10-45分钟的气氛。 从孵化器的多孔板和洗细胞3-4次，用4毫升透明细胞培养液中（例如的Opti-MEM中），以去除多余的染料。 显微镜阶段转移多孔板和连接到所需温度控制器/ 5％CO 2的进气口，在成像准备。 2。 FLIM的，在细胞中的荧光分子转子显微镜舞台上放置样品，并获得传输和荧光图像识别荧光细胞。一个实验装置示意图如图。 1.Verify，地点艰难的荧光发散反恐执行局（如细胞膜，细胞质）。获得荧光光谱，并确认这是染料或预期的蛋白质，在这种情况下，分子转子的频谱。作为阴性对照，图像非彩色样本和验证，它并没有发出荧光。虽然这一步是没有必要专门FLIM的，它是在总体上是好的做法，并帮助验证该样本是什么你认为它是。 切换到FLIM的模式 – 移动镜的荧光检测光路（“外部探测器”按钮“光束路径设置”面板上的Leica TCS SP2采集控制软件），这是很容易完成。一个适当的荧光过滤器来阻止任何兴奋的光芒到达探测器必须在荧光检测beampath的。 图1时域使用AC FLIM的实验安排。onfocal激光扫描显微镜。 扫描样本和检查，对计算机的控制FLIM的收购，探测器的计数率（黑条上标有收购贝克尔Hickl SPC的830板控制软件CFD）是不超过激光重复率约1％（绿色栏标记同步采集控制软件）。如果是的话，减少中性密度过滤器放置在激光束路径的激光激发强度，例如，以避免收集桩扭曲的荧光衰减曲线。 收购FLIM的形象，通常为3-5分钟，停止扫描并保存原始数据（三维数据的“魔方”组成的空间坐标x和y，时间）。 打开荧光衰变分析软件包的原始数据，例如三2月14日 ，商业软件，显示荧光强度图像。这简直是​​综合性的荧光衰减，即荧光衰减曲线下的面积，在每个像素。 选择一个典型的像素上放置光标，并检查该像素中的荧光衰减。如果峰值计数低于100，使用空间的像素分级。相邻像素的数量（例如3×3或5×5）被添加到中央的像素，以便获得更高的峰值计数有。这提供了一个为下一步的统计精度较高。另外，测量可重复采集时间较长（步骤5）。为30 – 50分钟，得到了一个高约10倍的峰值计数（总计数），但是这是远远太长引入文物由于样品运动，显微镜漂移，光的危险，因为大多数生物样品采集时间漂白。 选择一个全球性的像素阈值（上方装有一个像素的衰减）和适用于一个单一的指数衰减拟合的图像。结果产生一个以上的门槛，每个像素的荧光寿命，然后将其编码颜色。每个像素的颜色与合适的结果，并获得1 FLIM的地图。检查卡方值的减少，各种像素 – 约1（1.3），表示一个不错的选择。检查相应的残留物，而应随机分布在零附近。 荧光寿命直方图地块往往是某些荧光寿命与荧光寿命本身发生。调整色彩范围，荧光寿命分布到适合的颜色范围。 如果单指数拟合不产生约1卡方值（1.3），有一个从零残差系统偏差，需要一个更复杂的模型。例如，尝试双指数模型拟合荧光衰变为两个不同的环境探测可能的适当人选也将产生，这给染料的相对量的指示，在一个前指数的因素或振幅帐户环境MENT或其他。另外，拉伸指数函数可能是适当的，占了荧光寿命的分布。 的荧光寿命，指数前因子，寿命比，并为每个像素的指数前因子比对的结果，然后可以在色彩编码。每个像素是彩色的，根据其价值，由于荧光寿命，指数前因子及其比率的对比得出。再次，检查降低的卡方值（也可在彩色编码和图像显示） – 约1（1.3），表示一个不错的选择。检查残差，应随机分布在零附近。 荧光寿命直方图应陪同平均荧光寿命值，方便的可视化和荧光寿命分布的所有图像。 3。代表结果荧光衰变测量甲醇/甘油混合物的粘度增加，荧光分子转子如图。 2。是单指数荧光衰减，荧光寿命作为粘度的功能显着变化。它增加了从甲醇约300 PS（粘度0.6 CP）95％甘油（粘度950 CP）在3.4纳秒。 图2。肾上腺素-C的荧光衰变型材甲醇/甘油的混合物，不同粘度12 6。 数校准情节的荧光寿命τ与粘度η为荧光分子转子图。 3。福斯特·霍夫曼方程9的要求，它是一条直线 其中 k是radiativé速率常数，Z和 X是常数，0 <x <1。对数以双方产量 其中 x是直线的梯度。 图3。的日志荧光寿命比日志粘度积肾上腺素-12产量直线按照福斯特霍夫曼方程。 观察活细胞的培养与荧光分子转子状染料分布的荧光图像。 hela细胞培养与细观取代肾上腺素染料flim的图像显示在图。 4。可以充分使用一个单一的指数衰减模型拟合图像的每个像素中的荧光衰变。 <p class="jove_content"> 图4。（一）荧光强度和（二）与肾上腺素-12染色HeLa细胞FLIM的图像。明亮，圈点的地区表现出了比其他地区的寿命较短。这个短liftime对应的puncta在较低的粘度，可能是脂滴，根据福斯特霍夫曼方程。 通过绘制每个像素中提取的寿命，我们获得了整个图像的荧光寿命直方图如图。 5。 图5。荧光寿命从细观取代肾上腺素分子转子FLIM的HeLa细胞染色图像的直方图。