Modelado neuronal de señalización inmune de la migraña episódica y crónica mediante la depresión propagada In Vitro</em

Hay varios puntos la pena destacar de éxito en los estudios relacionados con la inmunidad de la señalización SD en rodajas de cerebro. En primer lugar, los estímulos deben iniciar de forma sincrónica despolarizar un volumen suficiente de materia gris del cerebro para iniciar SD. Esto significa que una configuración de interfaz (es decir, la exposición del líquido sólo abajo y el intercambio de gases por encima de insertar la cultura rebanada) es necesario. 1,2 rebanadas segundo lugar, mantener cerebral agudo SD pero el trauma de su preparación, así como el uso del 95% de oxígeno celular solución de Ringer generar pro-inflamatorias cambios y la conducta epileptiforme, respectivamente, lo que puede alterar la función de circuitos neuronales y la homeostasis inmune. 3 En tercer lugar, mientras que las culturas del hipocampo rebanada superar estas limitaciones corte aguda, es importante tener en cuenta que los cultivos de corte debe mantenerse por períodos adecuados antes de uso (es decir, más de 10 días in vitro) para que la microglía y los astrocitos se inactiva. 3.5 Finalmente, SD debe ser inducido mediante técnicas estériles y asépticos. Las técnicas que se describen a continuación están diseñados para satisfacer esta necesidad. 1. Difusión de la depresión en las culturas Cortar La cultura de preparación y mantenimiento. Cortar las culturas se preparan y se mantienen en caballos basado en suero medio o un medio libre de suero (SFM) 6,7 8 como se describió anteriormente, con modificaciones menores a la media. Parámetros de incubación de 36 ° C, 5% CO2, 95% de humedad de equilibrio del aire. Nos encontramos con que las culturas se puede cambiar a una ordenación forestal sostenible después de 18 días in vitro y mantenidos a lo menos 35 días in vitro mediante el uso de nuestros SFM previamente definido, que incluye suplementos de calcio y magnesio. Además, los antibióticos y una antifungicide se añaden para prevenir la contaminación infecciosa asociada con episodios de grabación múltiple. Esto a largo plazo (o grabación) de mediano formulación contiene (por 100 ml): media Neurobosal, 97 ml; Gema-21, 2,0 ml; Glutamax (200 mM), 0,5 mL, gentamicina (10 mg / ml), 10 l; D-glucosa (45%), 680 l, ácido ascórbico (0,5 M), 100 L, Fungizone, (250 mg / ml), 400 l, NaCl (5,0 M), 820 l, Mg 2 Cl 2 (1,0 M) , l 80; CaCl2 (1,0 M), 160 a 240 mL. Culturas se utilizan para SD 21 a 35 días in vitro. Verificación de la vitalidad 3,6,7. Culturas son examinados para detectar evidencia de muerte de las neuronas piramidales antes de su uso. A los 18 días in vitro, las inserciones se incuban durante 20 minutos en el medio (en condiciones normales de incubación) con 5 M Sytox Green, un marcador que se vuelve fluorescente cuando se une al ADN (es decir, al penetrar en las células muertas). Inserciones se transfieren de nuevo a su medio anterior y se examina con el microscopio de fluorescencia (504 de excitación y emisión 523) para pruebas de CA3 CA1 o lesiones piramidales capa de neuronas. Rebanadas con más de 20 células o un nivel estandarizado de mayor fluorescencia de 250 IU fueron excluidos de su uso posterior. Materiales de fabricación. Electrodos de tierra se hacen con tubos de vidrio (2,0 mm OD / 1,16 mm de diámetro) de corte de 4,5 mm de longitud y una breve pulidas al fuego en ambos extremos. Hacemos alrededor de 20 electrodos a la vez, que puede durar más de un año. Trae 100 ml de KCl 1M a hervir y añadir, con agitación, 3,5 g de agar y 0,5 g de EDTA (ácido etilendiaminotetraacético sal disódica dihidrato) para producir una solución de color amarillo claro. Use un pequeño tramo de tubo flexible provisto en cada tubo de vidrio para llamar la tibia KCl / agar solución en los tubos de vidrio, así como una corta distancia en el tubo flexible. Aspiración de liberación y permitir que el KCl / agar a gotear lentamente de la punta abierta del tubo de vidrio, a continuación, mantenga la punta del tubo de vidrio abierto contra un pedazo de hielo. La maniobra de este último solicitará al agar de gel en la punta del electrodo y no gel después de retroceder una copia de seguridad en el tubo de vidrio. Una vez que el agar se haya gelificado en el chorro de agua fría, el tubo flexible se puede quitar sin alterar el agar colocado en los tubos de vidrio. Coloque 0,5 ml de 1 M KCl en cada pocillo de una rejilla de tubo de centrífuga de 1,5 ml. A continuación, coloque un extremo de cada tubo de vidrio KCl / agar llena de pozos individuales. A continuación, mantenga una longitud de 80 cm de alambre de plata de calibre 15 con una pinza hemostática y limpiar cada uno de los cuatro lados por raspar el cable a través de una lima de cartón lugar a la encimera. Corte el cable en 4 cm de longitud y se colocan en un vial de centelleo llena de lejía durante 20-30 minutos para colocar una empresa de Ag-AgCl capa sobre la superficie de plata limpia. Doble cada alambre a la mitad e insertar los extremos libres en un extremo del tubo de vidrio lleno de wiª KCl / agar, dejando alrededor de 4.6 mm expuestos. Por último, cubra la espiga del tubo de vidrio que contiene el hilo de plata y una pequeña parte de los hilos con Goop, un pegamento resistente al agua y flexible, para evitar que el KCl / agar se seque. Repita para todos los electrodos. Deje que el pegamento se seque durante la noche. Tienda de los electrodos a 4 ° C en viales de centelleo (5-6 electrodos / vial) contiene ~ 5 ml de KCl 1 M y 25 mg de EDTA, que retrasa considerablemente el crecimiento de bacterias. Electrodos de registro se hacen de 1,5 mm de diámetro (0,86 mm de diámetro, 10 cm de longitud) tubos de vidrio de borosilicato con los filamentos (Figura Video 1). Tire de microelectrodos en una punta fina, con tubos de vidrio corta tiró a un punto agudo. Por lo general tirar de electrodos de ~ 7.5 cm de longitud con una inclinación de 1 cm. Esto permite un posicionamiento adecuado y la visualización de la punta del electrodo. Los electrodos se retiró con una Narishige PE-2 extractor. Consejos de microelectrodos se dividen de nuevo a 4.2 micras bajo visualización con un microscopio compuesto equipado con un micrómetro calibrado óptico. Usamos el borde de un portaobjetos de vidrio histología estándar (25 x 75 x 1 mm) unido a un sistema hidráulico unidimensional micromanipulador en manos de otra manipulador de 3 dimensiones para romper suavemente la punta de microelectrodos. En primer lugar, el electrodo se monta unido a un portaobjetos de microscopio con arcilla. A continuación, la diapositiva se coloca en el soporte de portaobjetos de microscopio que se utiliza para mover la punta de microelectrodos en el borde de la copa se deslizó adjunta al manipulador hidráulico. Por último, la punta del microelectrodo es ligeramente roto presionando contra el borde del portaobjetos del microscopio de accionamiento hidráulico. Electrodos de estimulación se retuercen de electrodos bipolares debido a que: Que permiten el registro de potenciales evocados campo, que de otro modo sería oscurecida por el artefacto de estímulo de la estimulación monopolar. Un electrodo bipolar se puede estimular suavemente aplicados a la superficie de la circunvolución dentada, sin lesiones, a diferencia de electrodos bipolares de punta afilada. Por último, le aplicaron corriente se localiza en la transversal (desnudo) superficies circulares de los cables con aislamiento de teflón utilizado para el electrodo. Fabricación de electrodo de estimulación se inicia con el corte de aproximadamente 20 cm de longitud de platino-iridio (125 m de diámetro descubierto, 200 m de diámetro con recubrimiento) y el alambre recubierto de teflón. Luego, doblar la longitud a la mitad y atar los cabos sueltos en un nudo de rizo suelto, dejando ~ 2 cm desde el nudo de los extremos del alambre. Asegurar el nudo en el mandril de un taladro eléctrico portátil colocado sobre una mesa. Mientras sostiene el otro extremo del cable con una pinza hemostática, brevemente a su vez el taladro encendido y apagado hasta que el cable esté bien trenzados (es decir, cada superficie de corte sería la misma distancia de la otra cuando el cable se corta en la dirección transversal, sin desvelar ). A continuación, los extremos desnudos de los cables de platino iridio-trenzado necesitan estar conectados para llevar los cables utilizados para conectar el electrodo de estimulación de un aislador de estímulo. Esto se hace mediante la soldadura de los extremos libres del alambre de platino-iridio a ~ 50 cables de calibre 30 cm. En primer lugar, la cinta el alambre de platino-iridio trenzado a una mesa de trabajo y la caída de un charco de ácido clorhídrico concentrado sobre un extremo libre del cable trenzado. A continuación, pelar alrededor de 1 cm de aislamiento de cada cable con un cortador de alambre. Coloque el extremo pelado de un cable adyacente al extremo de hilos trenzados y aplicar el calor de un soldador de punta fina, entonces la soldadura hasta que los dos cables están bien conectados. Slip una pequeña longitud de la tubería del encogimiento del calor sobre la conexión de los cables expuestos y reducirla en forma de calor. Repita el procedimiento para el segundo alambre. Fuego pulir la punta de una pipeta de 15 cm de Pasteur y la guía del trenzado de alambre de platino-iridio por la pipeta hasta unos 6 cm de la sobresale torcidos. Utilice un repelente de agua epoxi (por ejemplo, JB Weld) para sellar los dos extremos del electrodo. Por último, conecte los enchufes de plátano a los extremos del cable principal para la conexión con el seccionador de estímulo. Bajo observación estereoscópica, coloque la punta del electrodo en PBS y buscar burbujas electrolítico producido viene de sólo el extremo del corte de las puntas de los electrodos. Si las burbujas salen de los lados de los cables trenzados, cortar el electrodo con un corte transversal con una sola hoja de afeitar nueva ventaja para restablecer el aislamiento intacto a los ejes de hilo largo. Cuando la solución de problemas para resolver los efectos aberrantes de estímulo, intenta hacer una recién cortado la punta del electrodo. Platos de grabación consisten enlos piojos de insertar la cultura en un plato de 35 mm cultura que se asienta sobre dos barras de 1,0 x 12 mm de vidrio espaciadas aproximadamente 1,0 cm. Coloque las barras de cristal a la base de plato de calentamiento de los tubos de vidrio y luego comprimirlos en la base con una pinza. Para las condiciones de grabación estática, añadir 1,5 ml de medio al plato. A continuación, empapar un trozo cm ~ 10 mm de ancho y 3.4 de largo de algodón estéril en 1,0 ml de medio. Doble el algodón por la mitad a lo largo del eje mayor y el lugar a lo largo del interior y en la inserción con una pinza estéril. El algodón húmedo ayuda a mantener la humedad plato. Tres compresible 4 mm de longitud de la tubería son igualmente espaciados alrededor de la inserción. Cubra el plato fuerte con la película de cloruro de polivinilo, lo que permite el intercambio de gases. Corte alrededor de la mitad de pared vertical con una hoja de filo único para quitar exceso de película de cloruro de polivinilo. Configuración electrofisiológicos Una cultura de corte de montaje de inserción se coloca en la cámara de registro de CMS para las grabaciones electrofisiológicas. El conjunto del plato de insertar / cultura en la cámara de CMS está cubierto por un disco de plástico de 2 mm de espesor suministrado con la cámara de CMS, con varios orificios pequeños posicionados como sea necesario para los electrodos de las grabaciones, soporte de entrada / salida de los tubos, etc Nos seguimiento periódico de pH del medio con un electrodo combinado de pH y temperatura en miniatura con un tipo de miniatura T termopar montado en un semi-cerrado de microelectrodos para asegurarse de 7,3 pH y 36,0 ° C condiciones. La cámara de insertar / se airea con un 5% de dióxido de carbono-el equilibrio del aire y medio es celebrado estática o en un flujo (1,2 ml / minuto) de configuración con el centro de inserción a cabo en 35-36 ° C. Bajo condiciones de flujo, medio se calienta con un calentador de línea, una vez más para mantener el centro de la cámara de grabación a 36 ° C. Un sistema de bomba peristáltica con un medio de alivio de presión lleva a que las culturas rebanada sin pulsaciones de la bomba. Un aspirador se suministra con la cámara de CMS se utiliza para eliminar medio de la inserción a través de una suave succión. Para la estabilidad, la cámara está montada en un diseño especial de Burleigh Gibraltar-platina del microscopio invertido que tiene un microscopio invertido y se sienta en una mesa de vibración libre. Los agujeros pequeños se abren a través de la envoltura de cloruro de polivinilo insertar un pequeño instrumento de cauterización de pilas. A continuación, si una configuración de flujo se va a utilizar, de entrada y salida del flujo se inicia, seguida de la colocación de un electrodo de masa. De lo contrario, basta con poner el electrodo de tierra en su lugar. Electrodos, que se celebró en el lugar con micromanipulador, se sitúan justo por encima de una rebanada visualizarse con un microscopio invertido con un aumento de 5 veces (Fig. 1). Comience con el electrodo de registro seguido por el electrodo de estimulación. Nosotros usamos un monitor de audio para tener en cuenta cuando el microelectrodo se pone en contacto con la división. La punta se coloca en el punto medio a lo largo de CA3 capa piramidal cuerpo celular. Las grabaciones se han iniciado, y luego el electrodo de estimulación se tocó suavemente a la superficie del punto medio de la circunvolución dentada. En ambos casos, los movimientos iniciales de electrodos se llevan a cabo con los controles de grueso, y la posición final sólo con los controles hidráulicos, buen uso de la iluminación de contraste de fase de manera que las capas de células del cuerpo se pueden distinguir fácilmente. Electrodos de avanzar en incrementos de 25 m ~ bajo visión microscópica directa. Una vez que los electrodos tocar el tejido, el avance de los electrodos de otros 20-30 micras. Las grabaciones se inician antes de que el electrodo de estimulación se coloca en el lugar para estar seguros de que este no se activa SD (es decir, a través de un estímulo mecánico). ~ 10 minutos se permite que transcurra antes de los experimentos se han iniciado. Transynaptically inducida SD. Optimizar el potencial evocado CA3 campo de la siguiente manera (Fig. 2). CA3 potencial del campo son evocados con 100 pulsos ms (0,2 Hz) a partir de una corriente que es suficiente para desencadenar una respuesta (por ejemplo, ~ 5.1 mA). Mueva el electrodo de registro en incrementos a lo largo del eje piramidal neurona mucho tiempo hasta que el potencial del campo es máxima. A continuación, aumente la corriente con el electrodo de registro en esta posición y tomar nota de la respuesta máxima actual (por ejemplo, ~ 10-20 mA). Finalmente, el uso mitad de la máxima intensidad del estímulo para los experimentos (por ejemplo, simulacro de control de la estimulación periódica). Determinar el nivel de sinápticamente evocado SD (Fig. 2). Con los electrodos configurado como se describe más arriba para los potenciales evocados campo, cambiar el paradigma de la estimulación de ráfagas individuales, de forma manual evocadosde 10 pulsos (10 Hz a 100 ms / pulso), un paradigma aplicado previamente en estudios con animales conjunto. Incrementar progresivamente la intensidad de la corriente por ráfaga de estímulo hasta que se activa SD. Espere por lo menos 60 a 120 segundos entre estímulos. Informe SD umbral en culombios (es decir, el tiempo x corriente). En otros experimentos que requieren la medición de las respuestas a la inducción de múltiples desviaciones estándar, utilizar una fuerza de estímulo probable que evocan SD (por ejemplo, ~ 100-500 NC). Desencadenar SD cada 9 minutos durante una hora. Asegúrese de utilizar técnicas asépticas durante toda la experimentación. Después de la última SD, devuelva el insertar la cultura de las condiciones de incubación normal. Marque la placa de cultivo de tener en cuenta la cultura que han experimentado SD. Nuestra costumbre es colocar una sola marca a la izquierda y dos marcas a la derecha de la inserción de la cultura corte, teniendo en cuenta cada una de las tres culturas como la # 1, # 2 y # 3 de izquierda a derecha. Cambio de medio cada 3-4 días hasta la cosecha cultura. Para recurrentes SD, siga los procedimientos descritos anteriormente. Por lo general la prueba de un cambio en el umbral del 1 SD, 3, 7 y 14 días después de una hora inicial de múltiples desviaciones estándar. CA3 zona de gran potencial y posibles cambios lentos se registran a través de distintos sistemas de procesamiento de señal digital. 2. Imagen ejemplar Vital en las culturas rebanada hipocampo Comportamiento dinámico funcional de células inmunes residentes (es decir, microglia) de manera similar se puede controlar en parte las culturas sin daño celular o la activación inmune (Fig. 3) 9. Por ejemplo, para etiquetar microglia para evaluar sus movimientos asociados con cambios en la actividad sináptica de la SD, se utilizó fluoróforo marcado isolectina IB-4. "Lectina PBS" es PBS con cationes adicionales (0,1 mM de cada uno de CaCl 2, MgCl 2, MnCl2), ya que los cationes bivalentes (0,1 a 1,0 mM) se requiere que se unen a la lectina de α-D-galactosil fracciones en las membranas celulares microglial. Prepare una solución de "lectina PBS": De 1 L de PBS, utilizando una técnica aséptica y la filtración estéril, añadir: 100 L de 1 M de MgCl2 100 L de 1M MnCl2 100 L de 1 M de CaCl2 Mezcle bien para combinar y mantener refrigerado a 4 ° C. Sólo 500 L de "lectina PBS" es necesario por vial de isolectina, pero ya que se puede refrigerar y se mantuvo durante meses a la vez, puede ser útil para compensar un mayor volumen. Reconstituir AlexaFluor 594-etiquetados isolectina-IB4 (isolectina) liofilizado en polvo a 1 mg / ml en "lectina PBS". A fin de minimizar photobleaching, realice este paso lo más rápido posible, reduciendo al mínimo la exposición de luz. Isolectina puede alícuotas de 20 l, una vez reconstituido a 1mg/ml y se mantiene a -20 ° C hasta por un año. Diluir isolectina a 20 mg / ml en medio de cultivo y cultivos se incuban corte en condiciones normales de incubación de 40-10 horas antes de la imagen. Imágenes de set-up. Configuración de imagen se compone de: microscopio, el obturador, la cámara, la luz, 2,0 de densidad neutra de filtro, 36 ° C, el gas: 5% de CO2, el aire (o el 20% de oxígeno, balance de nitrógeno). A su vez en el microscopio, una cámara, la luz ultravioleta, control de temperatura, los gases y al menos una hora antes de exponer. Establecer MetaMorph Imaging Protocol. Desde el "Diario" en el menú desplegable, seleccione "Ejecutar …". Diario Esto debería incitar a la apertura de la carpeta de revistas, de los que debe seleccionar "movimiento w-var afs (diario establecido previamente que sigue los siguientes pasos)", haga clic en "Open". La "frecuencia de enfoque automático" se abrirá la ventana siguiente, mantener a un número, haga clic en "Aceptar". A continuación, el programa de instalación "secuencial de archivos Na …" Se abrirá la ventana, mantener todo como está: Nombre de la base: la imagen; Número: 1; Ancho Número: 3; Guardar como tipo: MetaMorph TIFF; si la imagen ya existe -> Sobrescribir automáticamente; Haga clic en "Seleccionar directorio …", esto hará que el" Buscar carpeta "ventana pop-up. Aquí, seleccione la carpeta (o crear una nueva carpeta), donde los cuadros de película se debe guardar. Entonces, cuando la carpeta correcta (por ejemplo C: \ Data \ Folder Nueva) se muestra en la parte inferior de la "instalación de Na secuencial de archivos …" ventana, haga clic en "Aceptar". En la ventana de adquirir: Seleccione la casilla en la esquina inferior izquierda se DiIMGBIN2; "Tiempo de exposición": 20ms, "Agrupación": 1. Luego, en la ficha especial: "Sensor Mode": FT; "Digitalizaciónzer ": 10MHz (Ganancia EM); "Gain": Gain3 (3x); Seleccione "EM Ganancia: 45", disparador de la cámara: Abierto para exponer; Completa el modo: EXP PRE CLARO; Borrar cuenta: 2, modo de disparo y el modo de disparo en vivo: Normal (TIMED). "Para Marcos media": 3. Haga clic en "Cerrar". Después de configurar la imagen MetaMorph, lugar de inserción en una placa de cultivo de 35 mm con dos varillas de 1 mm de vidrio en la parte inferior. Coloque tres piezas de 2 mm de tubo de goma colocada entre las paredes de la inserción y la placa de cultivo para estabilizar aún más la inserción. Coloque un pedazo ~ 10 mm de ancho de algodón empapado en un medio adicional de 1 mL interior de la inserción para mantener un ambiente húmedo. Asegúrese de que quede al ras con las paredes y lejos de las rebanadas de hipocampo. Cubra la parte superior de la placa de cultivo bien con la película de cloruro de polivinilo para evitar la pérdida de líquidos. Asegúrese de que el foco de la imagen es la capa de células piramidales CA3. Tenga en cuenta la orientación de la rebanada por la toma de fotografías en la fase 10x 5x y 20x. En el "encontrar un foco" de la ventana que aparece en la pantalla, ajustado en el actual + / – para ser "8", y la precisión en micras (s), a "1" (las dos cajas en la parte inferior debe ser comprobado) . Haga clic en "Buscar Focus" para asegurar una imagen en foco. En el "Adquirir Timelapse" ventana, seleccione Intervalo de tiempo para ser "un minuto", y la duración que se "6 horas" (estos son nuestros parámetros de adquisición preferente). Para capturar los movimientos con precisión la microglia, las imágenes no deben ser menos frecuentes que una vez por minuto. En Almacenamiento de la imagen, seleccionar la pila. La actualización de la imagen cuadro Ventana se debe comprobar, pero no las otras dos cajas que estaban debajo. Seleccione "Illum" ser "Lambda". Haga clic en "Aceptar". La película va a comenzar ahora a correr. Esto significa que ninguna otra cosa puede llevar a cabo dentro del programa MetaMorph hasta que termine el vídeo o hasta que deje la película a principios pulsando Esc, después de lo cual la película se detendrá en el paso siguiente adquisición oportuna. Al final de la película, compruebe si hay lesión de las células mediante el cribado Sytox como se señaló anteriormente (A). 3. La extracción de RNA de bajo nivel de la señalización de citoquinas 11-15 Hemos presentado previamente instrucciones detalladas para la detección de niveles bajos de citoquinas de señalización en las culturas sector mediante técnicas de PCR y qPCR matriz. 6,7 Hemos mejorado notablemente la sensibilidad de nuestros enfoques para la detección de mRNA de citoquinas en cultivos de corte y presentar estas mejoras aquí. Las mejoras incluyen nuestro enfoque de la cosecha de los tejidos y el aislamiento de ARN, preselección de muestras para el factor de necrosis tumoral alfa (TNF-α), el cambio, y preamplfication cDNA, que son aproximadamente 6 veces más sensible que las técnicas anteriores y, por ejemplo, permiten la detección de la primera vez de la cultura rebanada de interferón-gamma (IFN-λ) de detección de 15. PCR preparación. Cortar la cosecha cultura. Siguientes experimentos, se inserta la cultura rebanada se sumerge en 3.2 ml de ARN más tarde y se almacenan a 4 ° C durante un máximo de 3 días, hasta su posterior procesamiento. Para la cosecha, eliminar cuerpos extraños (es decir, todos los tejidos adyacentes al hipocampo) tejido con un bisturí de diamante y levantar los cortes en cada RNasa / DNasa libre de tubos de 1,5 ml de centrífuga que contiene 0,5 ml de fosfato estéril (PBS) con una pintura de punta fina cepillo. Muestras de giro (10.000 rpm x 1 min) de una manera estereotipada que todos los cortes se adhieran al mismo lado de los tubos. Quitar PBS sobrenadante y resuspender la muestra en 500 TRIzol l. Almacene las muestras a -80 ° C o mantener en hielo hasta la extracción de RNA. La extracción de RNA usingTRIzol con los resultados kit RNeasy Micro en un mayor rendimiento de ARN (Fig. 4) que el uso del kit solo. Descongele TRIzol muestras y se incuban a temperatura ambiente durante 5 min. Disociar la toma de muestras de tejido por arriba y abajo con 1 mL con punta de pippetor y / o agitación hasta que el tejido sólido ya no es visible. Añadir 100 ml de RNasa libre (RF) de cloroformo y se invierte el tubo 2-3 veces para mezclar. Incubar 3 min a temperatura ambiente, agitación cada minuto. Se centrifuga a 13.000 rpm durante 15 min a 4 ° C. Transferir el sobrenadante a un tubo de microcentrífuga limpio de 1.5 ml. Tenga cuidado de no perturbar la interfaz. Añadir un volumen igual de la temperatura ambiente RF 70% de etanol grado biología molecular (~ 300 l). Mezclar suavemente pipeteando arriba y abajo varias veces. Continúe con los pasos siguientes por instrucciones del kit RNeasy Micro: Aplicar la muestra a una columna de RNeasy micro colocado en un Collectio 2 mln del tubo. Centrifugar a 10.000 rpm durante 15 segundos, desechar el filtrado. Lavar la columna RNeasy con 350 l RW1 buffer. Centrifugar a 10.000 rpm durante 15 segundos, desechar el filtrado. Añadir 10 ul DNasa un solución madre de 70 RDD buffer l, mezclar suavemente. Aplique 80 l de solución de DNasa directamente sobre la membrana e incubar a temperatura ambiente durante 20 min. Lavar la columna RNeasy con 350 l RW1 buffer. Centrifugar a 10.000 rpm durante 15 segundos, desechar el filtrado y el tubo. Añadir 500 l de buffer RPE columna RNeasy. Centrifugar a 10.000 rpm durante 15 segundos, desechar el filtrado. Añadir 500 l RF 80% de etanol grado biología molecular a la columna RNeasy. Centrifugar a 10.000 rpm durante 2 min, descartar el filtrado y el tubo. Colocar la columna RNeasy en nuevos tubos con las tapas abiertas. Centrifugar a toda velocidad (es decir, 14.000 rpm) durante 5 min. Transferencia de columna RNeasy a un tubo de microcentrífuga de RF. Aplique 14 l de agua RF directamente a la membrana. Centrifugar a 10.000 rpm durante 1 min para eluir. Almacene las muestras a -80 ° C o seguir los siguientes pasos. ARN cuantificación. Diluir 1:200 en RiboGreen RF 1x Tris-EDTA (TE) de amortiguación. Prepare tRNA de levadura que se utiliza como el estándar de ARN. Acciones de trabajo se almacenan a -20 ° C a 100 mg / ml Diluir a 1 mg / ml (10 l en 990 l TE). Crear normas de la siguiente manera: Para 100 ng / mL, añadir 100 ml, el 80 ng / mL, añadir 80 y 20 tRNA l l TE, de 60 ng / mL, añadir 60 y 40 tRNA l l TE, de 40 ng / mL añadir 40 y 60 tRNA l l TE, de 20 ng / mL añadir 20 y 80 tRNA l l TE, y de 0 ng / mL añadir 100 ml de TE. Preparación de muestras: Combine 99 l TE + 1 l de la muestra. Ejecutar cada muestra por duplicado. Utilizando una pipeta multicanal, añadir 100 ml de RiboGreen diluido por pocillo. Pipeta de arriba a abajo para mezclar. Medir la fluorescencia en un lector de placas. Fluoresceína (485 nm/535 nm, 0,1 s) del programa. Exportar los resultados en una hoja de cálculo Excel. Determinar la concentración de ARN. Gráfico de absorción frente a la concentración de ARN y crear una línea de tendencia de regresión lineal en Excel. Determinar las concentraciones de ARN de la muestra a partir de la ecuación de regresión asociados a la línea de mejor ajuste. Determinar la calidad del ARN. La integridad del RNA ribosomal banda se mide a través de un gel de agarosa (Fig. 4). Aunque no es práctico para ejecutar una fracción de cada muestra de ARN obtenidos (desde = 1 g de ARN que se requiere y nuestros rendimientos son pequeños), es una buena idea ejecutar periódicamente un gel de agarosa desnaturalizante en una muestra ejemplar como prueba de que el método , cuando se hace correctamente, los altos rendimientos de ARN de calidad (es decir, sin degradación). Preparar un gel de agarosa al 1% (para un volumen de 100 ml). Limpiar el tanque de electroforesis, echando la bandeja y gel peines completamente con RNasa LEJOS. Pesar 1 g de agarosa ultrapura en un matraz. Añadir 83 ml de RNasa libre de agua y 10 ml de MOPS 10x [3 – (N-morfolino) propanosulfónico] buffer y de microondas hasta agarosa se disuelve y la solución es clara (~ 3 min). Para hacer tampón MOPS 10x Combine 83,7 MOPS g, 13,6 g de acetato sódico y 3,7 g de EDTA. Añadir 800 ml de RNasa libre de agua, mezcle hasta disolver. Ajustar el pH a 7.0 y completar a 1 L. Filtro de esterilización o de autoclave. Conservar a temperatura ambiente, protegido de la luz. Permitir gel para enfriar a 55 ° C y añadir 7 ml de formaldehído 37% (este paso se debe hacer en una campana para vapores químicos). Vierte el gel en la bandeja de fundición y permitir gel se solidifique en el capó. Preparar las muestras de ARN. ARN tampón de muestra (500 l, que dulce). Combine 50 MOPS 10x l, 250 l de formamida, 90 l de formaldehído 37%, 108 l RF H ​​2 O y 2 l de bromuro de etidio (solución stock de 10 mg / ml). A 1.10 mg de ARN, añadir el doble de su volumen con la muestra de amortiguación, para una dilución de tres veces. Desnaturaliza a 95 ° C durante 5 minutos, y luego enfriar en hielo durante 5 min. Giro briefly y la carga de la muestra completa en los pozos junto a una escalera de ARN (añadir colorante de carga si se desea). Electroforesis Llene la cámara con 1x buffer MOPS. Electroforesis a 50-75 voltios hasta que los marcadores han emigrado de 2/3rd la longitud del gel. Visualizar el gel en un transiluminador UV. Verifique que no 18S agudo y 28S ribosomal bandas de RNA (rRNA), y que la banda 28S es dos veces más intensa que la banda 18S (Fig. 4). ARN degradado tendrá un aspecto manchado, bandas difusas, o no se presentan una proporción de 2:1. Normalmente se utiliza para evaluar la densidad óptica de la calidad total del ARN. Aunque no es tan sensible, espectrofotometría UV a través de un Nanodrop es un medio rápido y eficiente de costos de verificación de la calidad del ARN. Busque la densidad óptica (DO) 260/280 proporción de 1.5 a 2.0. Tenga en cuenta que la solución en la que el ARN se resuspendió (buffer TE frente al agua) afectará a la relación de OD. PCR actividades. Pre-PCR de configuración Diseño de cebadores específicos Utilizando Primerblast NCBI http://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/ : Introduzca el número de genes objetivo Refseq adhesión. Especificar el tamaño del producto de PCR de 70 a 200 pb. Especificar una Tm de 55 a 72 °, con la diferencia de 5 ° menos entre adelante y atrás. Seleccione "Primer debe abarcar una unión exón-exón" para reducir el fondo genómica. De verificación Habilitar la especificidad de la rata Refseq base de datos de ARN para asegurarse de que los primers no reconocen objetivos adicionales. Elegir un primer par de resultados que se ajuste a los siguientes criterios: 18-30 bases de largo. Menos de 2000 bases, aparte de la plantilla. 40-60% de guanina-citosina contenido para asegurarse de unión estable de imprimación para la plantilla. La elección de un gen de referencia. No todos los genes de referencia será adecuado para su experimentales establecidas. Cada vez que se utiliza un nuevo paradigma, la estabilidad de su referencia debe ser verificada. Por razones de coherencia, se optó por utilizar uno de los genes de referencia de cuatro siempre en el arreglo de 2 RT PCR Profiler. Un gen buena referencia debe cumplir los siguientes criterios: Su nivel de expresión no se altera por el paradigma experimental. Se expresa en niveles similares a la del gen objetivo. Para seleccionar una referencia adecuada: Revisión de la literatura para identificar posibles candidatos para un gen de referencia estable en su sistema. Por ejemplo, hemos probado Rpl13a, ya que ha demostrado ser estable en los estudios de isquemia 11,12. Cartillas de diseño como se mencionó anteriormente (o encontrar primers ya validados por los genes de referencia común en una base de datos como RTPrimerDB http://www.rtprimerdb.org/ ). Optimizar primers junto con cebadores del gen diana (ver más abajo). Determinar qué candidato es de referencia más estable el uso de software como Normfinder (http://www.mdl.dk/publicationsnormfinder.htm), que calcula un valor de estabilidad para cada gen, basándose en la variación intra-grupo y selecciona el gen de la (s) con la menor expresión variación en las muestras. Por ejemplo, Rpl13a es un gen de referencia óptimo para SD (Fig. 4). Optimizar primers. Para obtener resultados consistentes y confiables de qPCR, primers tienen que cumplir con ciertos criterios de reproducibilidad, sensibilidad y especificidad. Lo mejor es probar estos parámetros para cada primer par nuevo. Reproducibilidad es la prueba de funcionamiento por técnicos repeticiones. La sensibilidad puede ser evaluada por el rendimiento con una curva estándar de cuatro sucesivas diluciones. La especificidad es determinada mediante la confirmación de un solo producto por el análisis de la curva de fusión y la electroforesis en gel (Fig. 5). Ejecutar una placa de qPCR para poner a prueba la calidad de sus iniciadores, y la concentración de los cebadores para ser utilizado. Usando cDNA sintetizado a partir de todo el cerebro de ARN, crear una curva estándar (serie consecutiva de 4 diluciones) de la siguiente manera: 1, 1:4, 1:16, 1:64, 1:256, y sin control de la plantilla (NTC) . Para cada dilución, ejecute un l cDNA en la duplicaciónte para cada concentración de los cebadores, (es decir, 100 nM, 200 nM, 300 nM). Confirmar que la asistencia técnica consistente duplicados dan los valores de Ct. Examine los valores de Ct de la curva de dilución. Gráficamente los valores de Ct de la concentración de cada una de las diluciones. El gráfico resultante deberá ser lineal con un coeficiente de correlación buena (es decir,> 0,95). Examine derretir curva para confirmar la presencia de un único producto de amplificación (es decir, solo pico). Si hay varios picos, o los picos no son similares, esto podría sugerir la contaminación, mispriming, primer-dimer artefacto, etc (Fig. 5). Un pico en la NTC es probable que se corresponden con dímeros de primers que se forman más rápidamente en ausencia de cDNA plantilla, y no debe ser una preocupación. Confirman los datos de la curva de fusión mediante la resolución de los productos amplificados en un 1% en gel de agarosa. Preparar un gel de agarosa al 1% (para un volumen de 100 ml) Pesar 1 g de agarosa en un matraz. Añadir 100 ml de 1X Tris-acetato EDTA (TAE) de amortiguación y de microondas hasta agarosa se disuelve y la solución es clara. 1 L 50x buffer TAE consta de 2 m de base Tris, 57 ml de ácido acético glacial, y 0,05 M EDTA (pH 8,0). Diluir tampón TAE 1x con agua destilada (concentración final: 40 mM Tris-acetato y 1,0 mM EDTA). Permitir gel para enfriar a 55 ° C antes de añadir bromuro de etidio a una concentración de 0,5 mg / ml. Vierte el gel en la bandeja de fundición y deje que se solidifique a temperatura ambiente. Para correr, un gel en la cámara de electroforesis llena de 1x TAE, se combinan 10 l de muestra de la placa de qPCR con 2 L de colorante de carga 6x, mezclar bien y la carga en los pozos junto a una escalera de peso molecular. Electroforesis en 50-150 voltios hasta que los marcadores han migrado a una distancia apropiada, dependiendo del tamaño esperado de su producto cDNA. Visualizar con un transiluminador UV. Confirme que la amplificación de PCR es de tamaño adecuado para su objetivo. Dímeros de primers será de alrededor de 50 pb. Pre-pantalla para el aumento de TNF-α. Ya que el TNF-α inicia reacciones inflamatorias en la periferia, sospechamos que esto es también cierto para el cerebro y el uso de la evaluación inicial de TNF-α ARNm como un marcador del estado de la cultura rebanada inmunológico (es decir, normal, farsa, y los grupos experimentales) antes de proceder al completo análisis conjunto PCR. Si es normal y la farsa de control de TNF-α niveles de ARNm no están dentro de un rango de entre ensayos encontrado en nuestro laboratorio, experimentos (es decir, normal, farsa, y los grupos experimentales) se descartan y no proceder a la completa gama análisis PCR. iScript cDNA síntesis. Para cada muestra de ARN, se combinan los siguientes en un tubo de PCR: 4 l de mezcla de reacción 5x, 1 l de la transcriptasa inversa, 25 ng de ARN, y RF H ​​2 O hasta un volumen final de 20 mL. Mezclar suavemente con la pipeta y el giro durante un breve instante. Incubar: 25 ° C, 5 min, 42 ° C, 30 min, 85 ° C, 5 min. Diluir 1:4 (añadir 60 l de RNasa libre de agua). Almacenar a -20 ° C o mantener en hielo hasta que esté listo para usar en cuestión de horas. qPCR para el TNF-α. Prepare una mezcla maestra para cada par de cebadores. Combine 12,5 l iQ SYBR verde, una mezcla de cebadores ly 10,5 l de agua por cada muestra. Por tanto nuestra Rpl13a y TNF-α primers, 200 nm, es la concentración óptima. Ajustar la cantidad de cebadores y el volumen de desperdicio que sea necesario en un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml de RF y mantener en hielo mientras se configura la placa. Establecer una placa qPCR con controles / fundas / Experimentales. Use 1 l de cDNA de la muestra por duplicado para cada gen. Añadir 24 l de la mezcla maestra a cada pocillo y la pipeta hacia arriba y hacia abajo para mezclar. Tenga mucho cuidado para evitar las burbujas, ya que interfieren con las lecturas de fluorescencia. Realizar 40 ciclos de amplificación por PCR: 95 ° C, 8.5min; 40 ciclos: 95 ° C, 10 seg, 60 ° C, 30 seg, 72 ° C, 20 seg / ciclo. Derrita la curva: 55 ° C, 1 min, 80 ciclos de incrementos de 0,5 ° C durante 10 segundos cada uno a partir de 55 ° C. Analizar los datos (método ΔΔCt;. Fig. 4). 13 la síntesis de cDNA PCR para las matrices. Calcular el volumen (l) de cada muestra que 250 ng de ARN. Elija una cantidad de ARN (100 ng a 1 mg) que constantemente se puede extraer de las muestras. RT 2 Kit primer capítulo – de acuerdo con las instrucciones del fabricante. En pocas palabras: Descongelar y girar hacia abajo todos los reactivos. Para cada muestra de ARN, se combinan los siguientes en un tubo de PCR: 250 ng de ARN, 2 l de ADN genómico de 5x (ADNg) buffer eliminación y agua hasta un volumen final de 10 mL. Mezclar suavemente con la pipeta y el giro durante un breve instante. Se incuba a 42 ° C durante 5 min. Se enfría en hielo durante 1 min. Mientras tanto, prepare la transcripción reversa (RT) cóctel (por muestra): Combine 4 l de 5x buffer RT 3, 1 l de imprimación y la mezcla de control externo, una mezcla de enzimas l RT 3, y 3 l de agua. Añadir 10 l de mezcla de RT para cada muestra y mezclar suavemente. Se incuba a 42 ° C durante 15 min. Detener la reacción mediante la incubación a 95 ° C durante 5 min. Añadir 91 l de RF H ​​2 O a cada 20 l de reacción de síntesis de ADNc (se diluye hasta un volumen final de 111 l). Mezclar bien con la pipeta. Almacenar a -20 ° C o mantener en hielo hasta que esté listo para usar en cuestión de horas. RT 2 Profiler PCR matriz. Las siguientes instrucciones siguen los de los fabricantes y se repiten aquí por conveniencia. Preparar los reactivos Descongelar y girar hacia abajo todos los reactivos. Preparar cócteles experimental: Combine 1350 L de 2 x 2 SABiosciences RT qPCR SYBR Green Master Mix, 102 l de cDNA diluido y 1248 l de RF H ​​2 O hasta un volumen final de 2700 mL. Retire con cuidado el conjunto de PCR de la bolsa sellada. Prescindir de un cóctel en un depósito de carga. Añadir 25 l de cada pocillo con una pipeta de canales múltiples. Selle cuidadosamente PCR placa matriz. Centrifugar la placa a 10.000 rpm durante 1 min a temperatura ambiente. Lugar en el hielo hasta que el programa está listo PCR. Ejecute el programa de ciclismo adecuado para su máquina. iCycler: 95 ° C, 10 min 40 ciclos: 95 ° C, 15 seg, 60 ° C, 1 min. Derrita la curva: 55 ° C, 1 min, 80 ciclos de incrementos de 0,5 ° C durante 10 segundos cada uno a partir de 55 ° C Analizar los datos. Seleccione "Auto calculados" para los ciclos de línea de base. Seleccione "Definido por el usuario" para la posición de umbral para establecer manualmente el valor de umbral. En "Ver registro", establecer el umbral en el tercio inferior de fase lineal de la trama de amplificación. Asegúrese de mantener el valor umbral de la misma a través de carreras. Exportación de datos. De entrada en un archivo de Excel. Subir a SABiosciences matriz PCR de análisis de datos. http://sabiosciences.com/pcrarraydataanalysis.php Seleccionar los genes de referencia – que utiliza Rpl13a. Nuestra práctica consiste en: Confirmar los resultados con al menos un duplicado serie PCR. Tres veces los cambios arreglo no necesita ser confirmada por ulteriores específicos de amplificación de PCR 6,7. Cambios en menos de 3 veces deben ser confirmados por posteriores objetivo específico de amplificación de PCR o el uso de arrays 2.3 PCR (2x para confirmar los cambios. Pre-amplificación de ADN se utiliza para analizar los objetivos esperados con ultra-baja expresión (Fig. 6). RT SABiosciences 2 de Nano PreAmp kit de síntesis de cDNA y mezclas de cebadores están diseñados para pre-amplificación de ARN para permitir el uso de pequeñas cantidades (100 a 100 ng) de ARN de la muestra para realizar una completa gama de PCR. Cada mezcla de cebadores permite la amplificación de 89 genes específicos de las plantillas de cDNA objetivo con un sesgo mínimo. Hemos utilizado este sistema como un medio para amplificar las señales de bajo nivel, tales como IFN-λ a un nivel detectable. RT 2 Nano PreAmp kit de síntesis de cDNA – de acuerdo con las instrucciones del fabricante. En pocas palabras: Descongelar y girar hacia abajo todos los reactivos. Para cada muestra de ARN, se combinan los siguientes en un tubo de PCR. 1-100 ng de ARN, 2 l de buffer ADNg eliminación de 5x y agua hasta un volumen final de 10 mL. Mezclar suavemente con la pipeta y el giro durante un breve instante. Se incuba a 42 ° C durante 5 min. Se enfría en hielo durante 1 min. </li> Mientras tanto, preparar el cóctel de RT (por muestra). Combine 4 l de 5x buffer RT 3, 1 l de imprimación y la mezcla de control externo, 1 l de mezcla de enzimas de síntesis de cDNA, 1 l inhibidor de RNasa, y 3 l de agua. Añadir 10 l de mezcla de RT para cada muestra y mezclar suavemente. Se incuba a 42 ° C durante 15 min. Detener la reacción mediante la incubación a 95 ° C durante 5 min. Almacenar a -20 ° C o mantener en hielo hasta que esté listo para su uso. amplificación de cDNA con cebadores específicos. Mezcle lo siguiente en un tubo de PCR: 12,5 l PCR Master Mix, 7,5 l primers específicos, y 5 l de cDNA diluido. Ejecutar 12 ciclos de amplificación por PCR. 95 ° C, 10 min. 12 ciclos: 95 ° C, 15 seg, 60 ° C, 2 min. Mantener a 4 ° C. Añadir 2 reductor de l reacción secundaria a cada muestra. Se incuba a 37 ° C durante 15 min. Detener la reacción mediante la incubación a 95 ° C durante 5 min. Añadir 84 l de agua RF de cada 27 l de reacción de amplificación de cDNA. Almacenar a -20 ° C o mantener en hielo hasta que esté listo para usar en cuestión de horas. Amplificar los objetivos individuales de genes usando cebadores y SAB SYBR verde Master Mix como se describió anteriormente. 4. Multiplexado ensayos Phosphoprotein de la señalización de citoquinas Mutliplexed fosfoproteína ensayos se utilizan para definir las citoquinas ligando del receptor de señalización hacia abajo (Fig. 7). Determinar la cantidad de proteínas totales en cultivos de corte. Culturas de la cosecha corte con cuidado, levantando rebanadas fuera de lugar y se inserta en 1 ml de frío (4 ° C) PBS. Tubos centrífuga durante 30 segundos y PBS quitar. Colocar en hielo seco hasta que termine la cosecha. Almacenar a -80 ° C. Homogeneizar las culturas rebanada de ensayo de la proteína total. Prepare el buffer de lisis celular de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Añadir inhibidores de la proteasa para un volumen total de buffer necesario para realizar al menos 200 l de tampón de lisis en cada cultura rebanada. Por ejemplo: añadir 20 l de Factor 1, 10 l de Factor 2, y 20 l de 500 mM PMSF en DMSO a 4,95 ml de tampón de lisis celular. Descongele las culturas corte en 200 l de tampón de lisis en hielo. Sonicar culturas rebanada cinco veces en un pulso por segundo y el lugar inmediatamente posterior en el hielo. Muestras Vortex durante 10 segundos. Centrifugar las muestras a 4 ° C durante 15 minutos a 13.000 rpm. Transferir el sobrenadante a un tubo limpio y mantener en hielo. Realizar análisis de la proteína total. Elaborar normas de proteína. Acciones reconstituir la albúmina sérica bovina (BSA) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Elaborar normas que van desde 0 hasta 1,000 mg / ml diluida en agua de alta pureza para el análisis de la proteína BCA. Calcular el volumen de reactivo de trabajo necesarios en función del número de muestras y repeticiones. Por ejemplo: (8 + 18 normas de muestras desconocidas) x (2 réplicas por muestra) x (0,2 ml de reactivo de trabajo que se necesita por tanto) = 10,4 ml de volumen total necesario para todas las muestras de carga en la microplaca. Ronda de hasta 12 ml de volumen total para asegurar un volumen suficiente. Cuando la mezcla de reactivos con un reactivo B para el reactivo de trabajo, algunos puede aparecer cierta turbidez, pero debe desaparecer en breve. Carga de 10 l de las muestras y estándares por pozo. Cargar 0,2 ml de reactivo de trabajo en los pozos. Cubrir la placa con cinta, y por espacio de 30 segundos para mezclar. Incubar la placa a 37 ° C durante 30 min. Placa de enfriar a temperatura ambiente (unos 10 minutos) antes de leer en un lector de placas a la longitud de onda de 595 nm. Construya una curva estándar utilizando Microsoft Excel con absorbancia vs concentración esperada. Un coeficiente de correlación bien es igual o superior a 0,98. Calcular las concentraciones de proteínas en las muestras mediante la ecuación lineal derivada de la curva estándar. Diluir las muestras en tampón de lisis de las mismas cantidades de proteínas y almacenar a -80 ° C hasta que esté listo para su posterior procesamiento. La concentración de proteínas debe oscilar desde 200 hasta 900 mg / ml de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Realizar ensayo múltiple. Nota: multiplexado ensayos fosfoproteína tomar 2 días en total para completar, con 1 hora de la configuración inicial y la carga de placa seguida de una noche a la mañana incupaso incubación e incubación adicional y lavado de pasos al día siguiente. Planifiquen los pozos contienen lisado que de acuerdo a la hoja en el manual. Descongelar las muestras de tejido homogeneizado y lisados ​​kit a temperatura ambiente y luego colocar en hielo. Traiga todos los tampones y reactivos suministrados en el kit a temperatura ambiente (excepto estreptavidina y cuentas). Preparar cuentas para el ensayo multiplex. Los tubos de la cubierta que contiene perlas, junto con papel de aluminio para protegerlo de la luz. Tubos Vortex durante 5 segundos y mantener en hielo. Diluir cuentas junto 1:50 en tampón de lavado. Cada pocillo debe contener una L de cuentas junto en 49 l de tampón de lavado para un volumen total de 50 l por pocillo. Calibrar el aparato de vacío. Lavar la placa con 100 l de tampón de lavado por pocillo. Activar el vacío y succión exceso de líquido dentro de 2-5 segundos. Si la eliminación completa de buffer lleva más o menos de 2.5 segundos, ajuste la válvula de presión en consecuencia. Seque la parte inferior de la placa de fondo antes de añadir las muestras. Vortex las cuentas diluida junto durante 5 segundos y añadir 50 l de pozos designados. Inmediatamente filtro de vacío y seco de la parte inferior de la placa con una toalla de papel. Lavar la placa dos veces con 100 l de tampón de lavado por pocillo. Seque la parte inferior de la placa después de cada lavado. Vortex descongelar las muestras durante 3 segundos y añadir 50 l de pozos designados. Coloque cinta aislante sobre la placa e incubar durante 15-18 horas con agitación a 300 rpm a temperatura ambiente, protegido de la luz. Filtro de vacío el exceso de líquido y lava la placa tres veces con 100 l de tampón de lavado. Seque la parte inferior de la placa después de cada lavado. Diluir 1:25 la detección de anticuerpos en el tampón de lavado. Cada pozo requiere una detección de anticuerpos l en un volumen total de 25 l de tampón de lavado. Coloque cinta aislante en la placa y protegerlo de la luz con papel de aluminio. Por espacio de 30 segundos, incrementando gradualmente la velocidad a 1100 rpm. Continuar con agitación a 300 rpm durante 30 minutos a temperatura ambiente. Filtro de vacío de la placa y lavar tres veces con 100 l de tampón de lavado. Seque la parte inferior de la placa después de cada lavado. Al tiempo que protege la placa de la luz, preparar una dilución 1:100 de estreptavidina-PE con el volumen suficiente como para añadir 50 l por pocillo. Proteja la solución de la luz. Vortex a fondo y añadir 50 l diluido estreptavidina-PE por pozo. Incubar con agitación a 1100 rpm durante 30 segundos, seguido de 10 min a 300 rpm. Vacío el exceso de tampón de filtro. Lavar la placa tres veces con buffer de resuspensión de 100 l por pocillo. Seque la parte inferior de la placa de fondo después de cada lavado. Añadir 125 l resuspensión de amortiguación en cada pocillo y agitar durante 30 segundos a 1100 rpm. Lea inmediatamente la placa o se almacenan a 4 ° C de la luz durante un máximo de 24 horas. 5. Imitando y la modulación de la señalización de citoquinas Proteínas recombinantes citoquinas (con soporte) se utilizan para simular los cambios de la SD. Proteínas liofilizadas (por ejemplo, TNF-α) se almacenan durante un máximo de 1 año a -20 ° C. Después de diluir con una solución de reserva con 0,1% de suero bovino alícuotas de albúmina, se preparan, almacenan a -20 ° C, hasta su uso a menos de 3 meses. Cualquier manipulación de las culturas rebanada se actualizan por lo menos cada tercer día. La señalización de citoquinas es silenciada por: El uso de citoquinas tradicionales de señalización en cascada agentes farmacológicos; El uso del antagonista ligando soluble [receptor, por ejemplo, TNF soluble 1 (como se describió anteriormente para los ligandos recombinantes)], o El silenciamiento de genes [es decir, pequeños ARN de interferencia (siRNA)]. La entrega de siRNA en las células neuronales es a menudo problemática. Comunes basadas en lípidos reactivos suelen dar lugar a la eficiencia de transfección de baja y la pérdida de la viabilidad celular. En cambio, usamos Dharmacon Thermo Scientific es Accell siRNAs, que permiten la caída de alto rendimiento sin la utilización de un reactivo de transfección. Aquí se muestra la precipitación de la ciclofilina B, una proteína no esencial se expresa en todos los tipos celulares, como la confirmación de la utilización de este método en los cultivos de división. Protocolo de entrega se ha adaptado a las culturas sector a partir de las instrucciones del fabricante para su uso en células adherentes. Diluir tampón 5x siRNA a 1x con agua libre de RNasa. Prepare una solución de siRNA 100μM en 1x buffer Ciclofilina siRNA B se proporciona a los 5 nmol. Resuspender en 50 l de tampón 1x para una acción M 100. Mezclar con siRNA Accell entrega medium hasta una concentración final de 1μM siRNA. Añadir 11 l de 100 acciones siRNA M hasta 1100 l de medio de entrega Accell en una placa de 6 pocillos. Lugar en la incubadora y permitir que la temperatura se equilibre con las condiciones de incubación normal por lo menos 20 min. Utilizando una campana de BSL-2 y una técnica estéril, se inserta la transferencia a la mezcla que contiene la entrega de pozos. Incubar con la mezcla de entrega de 96 horas para la caída de proteínas. Evaluar la caída de proteínas por Western blot o intensificarse, en la inmunotinción. Las transferencias Western, mientras que una opción potencial de primera para la eficiencia caída, puede ser demasiado insensible para bajo nivel de señalización inmune asociado con el fenómeno no perjudicial de la SD. En consecuencia, hemos seguido las medidas de Western blot negativos con la plata mejor diaminobencidina (DAB) y tinción equipo basado en mediciones de densitometría (ver más abajo). 6. Confirmaciones de proteómica Especificidad de los cambios celulares fosfoproteína se establece mediante inmunotinción 6,7. Fix culturas corte durante 24 horas con el fijador PLP que consiste en: 10 ml de paraformaldehído al 16%, 1,096 g de lisina, 0,42 g de fosfato de sodio y 0,17 g de peryodato de sodio, lleno hasta un volumen total de 80 ml con agua ultrapura (fijador es de 6,2 pH). Después de 24 horas, retire suavemente culturas sector a partir de los insertos con un pincel fino y la transferencia a la azida de sodio que contiene PBS (100 mg / L) hasta que esté listo a la sección. A continuación, se incuban las rebanadas al menos 24 horas en PBS-20% de sacarosa, corte culturas enteras rebanada de 20 micras secciones, y montaje de diapositivas gel recubierto. Tinción fluorescente (por ejemplo, para NFkB) se lleva a cabo de la siguiente manera con todos los pasos, junto a la agitación a ~ 50 rpm. Lávese las culturas rebanada en 3 ml de PBS tres veces durante 10 min. Colocar los portaobjetos con 20 montados culturas rebanada micras en frascos de Coplin con PBS ~ 40 mL para todas las etapas de lavado. Lávese las culturas de división en PBS tres veces, 10 min por lavado. Ponga unas gotas de SFX potenciador de señal en las culturas de corte y se incuba en una cámara húmeda durante 30 minutos. Incubar los cultivos rebanada de 2 horas a 37 ° C con conejo anti-NFκβ anticuerpos a 1:100 diluido en 0,75% Triton X-100 en PBS. Adición de la solución de anticuerpos directamente en rodajas. Quitar las rebanadas de solución de anticuerpos y se lavan tres veces en PBS durante 10 min por lavado. Incubar las rebanadas a temperatura ambiente durante una hora en la cabra anti-conejo AlexaFluor 594 anticuerpos a las 1:50 en el 0,75% de Triton X-100 en PBS. Centrífuga AlexaFluor 594 anticuerpos durante 15 minutos a 10.000 rpm para eliminar cualquier precipitado que puede haberse formado en la solución. Lavar tres veces en PBS, 10 min por lavado. Sumerja los portaobjetos en agua destilada para eliminar cualquier resto de sales de PBS. Cubreobjetos con prolongar Antifade medio y dejar secar por lo menos 2 horas, cubierta de la luz. Visualizar con el tradicional o confocal (Fig. 7) microscopía de fluorescencia. Cambios en la producción de proteínas de la caída siRNA puede ser evaluado mediante la mejora de sensibilidad DAB tradicionales inmunotinción 7 a través de la intensificación de la plata 16 y su posterior cuantificación densitométrica (por ejemplo, como se muestra aquí para la ciclofilina B) (Figura vídeo 2). La inmunotinción para la ciclofilina B sigue los procedimientos estándar para la imagen de campo claro hace poco detallada, 7 con: Anti-ratón de la ciclofilina B (1:100) durante 24 horas a 4 ° C; Seguido por el etiquetado peroxidasa secundaria de anticuerpos (1:100); DAB y visualización. f las reacciones DAB son demasiado débiles para permitir quantification17 densitometría digital, que puede ser intensificado con un procedimiento de plata diferenciados de acuerdo con Quinn y Graybiel 16. Rehidratar diapositivas y luego lave x 3 durante 10 minutos en agua de alta pureza. Colocar los portaobjetos en agua de alta pureza en un frasco de Coplin y caliente a 56 ° C. Prepare una solución amoniacal de nitrato de plata (0,5%): Cloruro de amonio de valores (25-30%) es recién diluido (1:1) con agua de alta pureza. Añadir hidróxido de amonio (~ 500 a 600 l por cada 100 ml) gota a gota con agitación a la solución de nitrato de plata 0,5%, lo que a su vez, brevemente nublado y claro entonces. Caliente la solución a 56 ° C. Incubar las secciones de 10-12 min. Lavar los portaobjetos durante 15 segundos en agua de alta pureza (este y todos los pasos posteriores se realizaron a temperatura ambiente utilizando jarras Coplin). Sumerja los portaobjetos durante 15 segundos en el tiosulfato de sodio al 1% (pentahidrato). Sumerja los portaobjetos durante 15 segundos en agua de alta pureza. Tono de las diapositivas durante 2 minutos en cloruro de oro 0.2%. Sumergir los portaobjetos en agua de alta pureza durante 15 segundos. Exponer las diapositivas a 0,5% de ácido oxálico durante 2 min. Sumergir los portaobjetos durante 15 segundos en agua de alta pureza. El tratamiento de las diapositivas durante 5 minutos en tiosulfato de sodio al 5%. Lavar los portaobjetos a fondo en agua de alta pureza, se deshidrata y cubreobjetos. Diapositivas ya están listos para la cuantificación densitométrica 17. Todo el equipo, incluyendo la iluminación de campo claro, se enciende por lo menos 20 minutos antes de la imagen. Sectores enteros cultura de división son fotografiadas a 5-10x en un microscopio invertido. Intensidad de la luz se establece en un nivel uniforme (por ejemplo, ~ 2.6 V) y no ha cambiado a lo largo de todas las adquisiciones de la imagen. Filtros de densidad neutra se utilizan según sea necesario para reducir la imagen completa de transmisión intensidad de la luz a ~ 1500 en una escala de 12-bit (0-4095), donde "0" es completamente negro y 4095 es completamente blanco. Las imágenes digitales son luego adquiridas y almacenadas electrónicamente para todos (es decir, el control de farsa y muestras experimentales), incluyendo una imagen de fondo derivadas forman un área de la diapositiva sin secciones cultura rebanada. La imagen de fondo se resta de todas las imágenes (simulado y experimental) y un área de interés (AOI), elaborado en torno a la cultura de cada rebanada y se transmite la intensidad de luz registrados. Rango de intensidad de la imagen se establece en un rango constante para todos los experimentos. Para mayor claridad, resultante expresada como densidad relativa en comparación con los niveles de control (Fig. 8). 7. Los resultados representativos: Figura 1. Cultura rebanada paradigma electrofisiológicos de grabación. Microelectrodo de grabación será colocada en la capa de neuronas piramidales CA3 y un electrodo bipolar estimulante se coloca en el giro dentado (DG). Figura 2. CA3 potenciales evocados de campo y difusión de la depresión inducida por sinápticamente. (A) Los experimentos comienzan con la determinación de la corriente necesaria para maximizar el nivel de campo CA3 respuestas área potencial y mitad de la máxima intensidad se utiliza para obtener CA3 área de potenciales evocados campo. Este documento de la normalidad de las respuestas evocadas sinápticas entre las preparaciones. Si los potenciales de un trozo de campo de excitación postsináptica no son por lo menos 3 mV, rodajas se descartan. (B) umbral A continuación, trans-sinápticamente evocado para desencadenar la depresión propagada es determinado (respuestas correctas, lento), mientras que en los potenciales de campo mismo tiempo (a la izquierda , la respuesta rápida) se utilizan para documentar que los preparativos están lo suficientemente sano como para seguir la estimulación 10 Hz (por ejemplo, las amplitudes de las desviaciones verticales en los registros rápidos potenciales son similares). Figura 3. Movimiento microgliales asociadas con la reducción de la actividad sináptica. La evidencia muestra que las ramas microglial extender y retraer la actividad sináptica aumento, pero a larga distancia el movimiento de estas células en respuesta a la actividad sináptica no se ha descrito en el cerebro sano. Nuestros resultados con fluorescentes etiquetado isolectina B4 de mostrar microglia que una fracción de estas células se mueven a grandes distancias en condiciones normales. Además, el número de estas microglia viajar aumenta cuando la actividad sináptica es abolida por la exposición a la tetrodotoxina la cultura como se muestra en la imagen adjunta. Líneas rojas marcan caminos recorridos por la microglía durante un período de 6 horas con flechas de color azul que marca el origen de un ejemplar de unos pocos microglia. Barra de calibración, de 50 micras. Figura 4. PCR actividades de detección. (A) Nuestro método de TRIzol junto con los kits de Qiagen para el aislamiento de ARN, ya que, en nuestras manos, el resultado es significativamente mayor (p <0,001; t-test). ARN rendimiento de los cultivos rebanada hipocampo que el uso de kits de Qiagen solo (B) En Además, periódicamente confirmar que nuestros procedimientos de extracción de RNA produce ARN de alta calidad intacta como se determina a través de un gel que muestra nítidas bandas de ARN. (C) Utilizamos el software NormFinder para elegir un gen de referencia con un mejor valor de la estabilidad. Por ejemplo, las culturas porción expuestaa lipopolyssacharide (100 ng / ml durante 2 horas) fueron analizados por tres genes de referencia (Rpl13a, β-actina, de 18 años). Los valores de Ct se utilizan para calcular el valor de la estabilidad. Nuestros datos aquí [y que para otros experimentos utilizando la depresión propagada (datos no mostrados)] muestran que Rpl13a es un gen de referencia óptimo. (D) Usamos el "ΔΔCt" método como un método sensible y reproducible para detectar veces de cambio de las diferencias entre los grupos experimentales ARN y los controles sham. Figura 5. PCR cheques reacción. (A) Medimos ampliaciones de dilución de la curva de primers como un medio para verificar la calidad de las reacciones de PCR. Por ejemplo, ampliaciones óptima mostrar un uniforme (1-5) aumento de los umbrales Ct. (B) Por el contrario, ampliaciones no son uniformes con las cartillas pobres (1-5). (C) Además, realizamos una curva de fusión en el conclusión de los ensayos de PCR para confirmar que los amplificados se detectan deseado (es decir, una curva solo pico), lo que indica la ausencia de ADN de doble cadena como dímeros de primers, la contaminación de ADN y el producto misannealed PCR (que aparecen como curvas de pico múltiple). Figura 6. Nano pre-amplificación permite la detección de IFN-λ en cultivos de corte del hipocampo. Dado que sólo ~ 50 células T se encuentran en una cultura de corte (de un total de ~ 55,000-90,000 total de células), se utilizó el RT 2 nano PreAmp Kit de síntesis de cDNA como una forma de detectar posibles ultra-bajo nivel de expresión de IFN-λ. Este medio de preamplificación cDNA proporcionado un aumento de 12 veces en la sensibilidad a los niveles de ARN. Los resultados mostrados anteriormente ilustran la capacidad de preamplificación para aumentar la sensibilidad de detección. Ct umbral de referencia gen Rpl13a fue de 20,5 con la amplificación inicial y se incrementó a 14.1 con el uso del kit de preamplificación, un aumento de 12 veces que corresponden a 12 ciclos de amplificación por PCR del DNA. En paralelo, el IFN-λ no era detectable (0,0), pero fue dentro del rango de detección (29,0) con preamplificación. Figura 7. Innato de citoquinas vía cambios fosfoproteína fosforilación. (A) efecto ejemplar de TNF-α tratamiento previo (es decir, la neuroprotección) en la fosforilación de la fosfoproteína innata de citocinas vía de 24 horas después de la lesión excitotóxica en cultivos de corte del hipocampo. Los resultados muestran cambios en el área CA1 entre cortes pretratados durante 3 días con 100 ng / ml de TNF-α antes de la exposición a la N-metil-D-aspartato (NMDA) en comparación con los expuestos a NMDA solo (es decir, experimental vs sham), expresada en porcentaje. Tenga en cuenta que el TNF-α inducida por un aumento sostenido de la fosforilación de JNK y ATF-2, así como un aumento transitorio de NFkB. (B) La distribución espacial de la activación de NFkB (es decir, la presencia de NFkB fosforilado en el núcleo) se revela por inmunotinción ( rojo). YoYo manchas verdes núcleos en una sección de cultura de corte [por ejemplo, en los astrocitos (punta de flecha)]. Las neuronas piramidales, que de otro modo también aparecen de color verde, en lugar de amarillo porque son de la marca concomitante con fosforilada NFkB (rojo). Barra de calibración, de 25 micras. Figura 8. . Proteómico de la confirmación de la eficacia del siRNA intensificación de plata diferenciados de tinción con peroxidasa diaminobencidina base para la ciclofilina B muestra que siRNA significativamente (P <0,001; ANOVA-Holm-Sidak método) reducir mundial rebanada hipocampo ciclofilina B expresión 3 días después de la aplicación de 200, 500 , o 1.000 nM siRNA.