Modelagem Neural Sinalização Imune de migrânea episódica e crônica Usando a depressão alastrante In Vitro</em

Vários pontos são importante ressaltar para o estudo sucesso de sinalização relacionadas ao sistema imunológico SD em fatias de cérebro. Em primeiro lugar, os estímulos devem iniciar de forma síncrona despolarizar um volume suficiente de matéria cinzenta do cérebro para iniciar SD. Isto significa uma configuração de interface (ie, a exposição de líquidos só abaixo e troca gasosa acima inserir a cultura fatia) é necessária. 1,2 segundo, fatias cerebral aguda sustentar SD, mas o trauma de sua preparação, bem como o uso de 95% de oxigênio-gasosas solução de Ringer gerar pró-inflamatórias mudanças e comportamento epileptiforme, respectivamente, o que pode alterar a função do circuito neural e homeostase imunológica. 3 Terceiro, enquanto culturas fatia hipocampal superar essas limitações fatia aguda, é importante notar que as culturas fatia deve ser mantido por períodos adequados antes uso (ou seja, superior a 10 dias in vitro) para que microglia e astrócitos tornar quiescente. 3-5 Finalmente, SD deve ser induzido usando técnicas estéreis e assépticas. As técnicas descritas abaixo são projetados para atender a essa necessidade. 1. Depressão alastrante em culturas Slice Preparação e manutenção da cultura. Cultura de lâminas são preparadas e mantidas em meio de soro de cavalo ou com base em um meio isento de soro (SFM) 6,7, como descrito anteriormente 8, com pequenas modificações para o meio. Parâmetros de incubação de 36 ° C, 5% CO 2, 95% de umidade do ar de equilíbrio. Nós achamos que as culturas podem ser comutada para um SFM após 18 dias in vitro e mantidos a pelo menos 35 dias in vitro pelo uso do nosso SFM previamente definido, que inclui cálcio e magnésio. Além disso, os antibióticos e uma antifungicidas são adicionados para evitar a contaminação infecciosa associada a episódios de gravação múltipla. Este longo prazo formulação médio (ou gravação) contém (por 100 mL): médio Neurobosal, 97 mL; Gem-21, 2,0 mL; Glutamax (200 mM), 0,5 mL; Gentamicina (10 mg / mL), 10 mL; D-glicose (45%), 680 mL, ácido ascórbico (0,5 M), de 100 L; Fungizone, (250 mg / mL), 400 mL; NaCl (5,0 M), 820 mL, Mg 2 Cl 2 (1,0 M) , 80 mL; CaCl 2 (1,0 M), 160-240 mL. Culturas são usados ​​para SD 21-35 dias in vitro. Verificação de vitalidade. 3,6,7 Culturas são avaliados para a evidência de morte de neurônios piramidais antes de usar. Aos 18 dias in vitro, as inserções são incubados por 20 min em média (em condições de incubação normal) contendo 5 mM Sytox Green, um marcador que se torna fluorescente quando se liga a DNA (ie, penetrando em células mortas). Inserções são então transferidos de volta para o seu meio anterior e examinados com microscopia de fluorescência (excitação 504 e 523 de emissão) para a evidência de CA3 ou CA1 lesão piramidal camada de neurônio. Fatias com mais de 20 células ou um nível padronizado de fluorescência maior do que 250 UI foram excluídos do uso posterior. Fabricação de materiais. Eléctrodos de massa são feitos com tubos de vidro (2,0 mm OD / ID 1,16 mm) corte a 4,5 mm e comprimentos brevemente fogo polida nas duas extremidades. Fazemos cerca de 20 eletrodos em um momento, que pode durar mais de um ano. Trazer 100 mL de KCl 1M para ferver e adicionar, com agitação, 3,5 g de ágar e 0,5 g de EDTA (ácido etilenodiaminotetracético sal dissódico dihidratado) para produzir uma solução amarela clara. Use um pequeno pedaço de tubo flexível montado sobre cada tubo de vidro para chamar a solução de KCl / agar quente em tubos de vidro, bem como a uma curta distância no tubo flexível. Sucção liberação e permitir que o agar / KCl a escorrer lentamente para fora da ponta aberta de um tubo de vidro, em seguida, segure a ponta do tubo de vidro aberto contra um pedaço de gelo. A manobra de último solicitará o ágar de gel na ponta do eletrodo e não gel, após recuo de volta para dentro do tubo de vidro. Uma vez que o agar gel tem na água fria em execução, o tubo flexível pode ser removido sem alterar o agar posicionados nos tubos de vidro. Coloque 0,5 mL de KCl 1 M em cada poço de um suporte para tubos de 1,5 mL de centrifugação. Em seguida, coloque uma ponta de cada tubo de vidro de KCl / agar preenchidos em poços individuais. Em seguida, realizar um comprimento de 80 cm de fio de prata calibre 15 com uma tesoura cirúrgica e limpar cada um dos quatro lados raspando o fio através de uma placa de Emery realizada ao balcão. Corte o fio em 4 cm e comprimentos colocá-los em um frasco de cintilação cheio de água sanitária por 20-30 minutos para colocar um casaco firme Ag-AgCl sobre a superfície de prata limpa. Dobre cada fio ao meio e coloque as extremidades livres em uma extremidade do tubo de vidro cheio wiª KCl / agar, deixando cerca de 4-6 mm expostos. Finalmente, o revestimento do tubo de vidro contendo haste do fio de prata e uma pequena extensão do fio com Goop, uma cola resistente à água e flexível, para impedir que o KCl / agar de secagem. Repita o procedimento para todos os eletrodos. Deixe a cola secar durante a noite. Armazenar os eletrodos a 4 ° C em frascos de cintilação (5-6 eletrodos / frasco), contendo 5 mL ~ 1 M KCl e 25 mg de EDTA, o que retarda significativamente o crescimento bacteriano. Eletrodos de registro são feitos de 1,5 mm de diâmetro (0,86 mm de diâmetro, 10 cm de comprimento) tubos de vidro de borosilicato com filamentos (Figura Video 1). Puxe microeletrodos para uma ponta fina com tubos de vidro curtas puxado para uma ponta afiada. Normalmente, puxar eletrodos ~ 7,5 cm de comprimento com um cone de 1 cm. Isto permite adequado posicionamento e visualização ponta do eletrodo. Eletrodos são puxados com um PE-2 Narishige extrator. Dicas de microeletrodos são quebrados de volta para 2-4 mM sob visualização através de um microscópio composto equipado com um micrômetro calibrado óptica. Usamos a borda de uma lâmina de vidro padrão histológico (25 x 75 x 1 mm) conectada a um micromanipulador unidimensional hidráulica realizada por outro manipulador 3-dimensional gentilmente quebrar as dicas de microeletrodos. Primeiro, o eletrodo é montado anexado a uma lâmina de microscópio utilizando argila. Em seguida, o slide é colocado no suporte lâmina de microscópio, que é usado para mover a ponta microeletrodo perto da borda do copo deslizou anexado ao manipulador hidráulico. Finalmente, a ponta do microeletrodo é suavemente quebrado, pressionando-o contra a borda acionado hidraulicamente microscópio slide. Eletrodos estimulantes são torcidos eletrodos bipolares fio porque: Eles permitem a gravação de potenciais evocados de campo, que de outra forma seria obscurecida pelo artefato de estímulo da estimulação monopolar. Um eletrodo bipolar estimulante pode ser gentilmente aplicada sobre a superfície do giro denteado, sem danos, ao contrário de eletrodos de ponta aguçada bipolar. Finalmente, corrente aplicada é localizada na transversal (nu) superfícies circulares dos fios de teflon utilizada para isolamento do eletrodo. Fabricação de eletrodos estimulantes começa com o corte de ~ 20 cm de comprimento de platina-irídio (125 mM nua diâmetro, 200 mM de diâmetro revestido) e fio revestido de teflon. Em seguida, dobre o comprimento no meio e amarrar as pontas soltas em um nó frouxo quadrados, deixando ~ 2 cm do nó para as extremidades do fio. Fixe o nó no mandril de uma furadeira manual elétrica colocado sobre uma mesa. Enquanto segura a outra extremidade do fio com uma pinça hemostática, por sua vez brevemente a broca e fora até que o fio está fortemente trançado (ou seja, cada superfície de corte seria uma distância igual do outro quando o fio é cortado no sentido transversal, sem desvendar ). Em seguida, as extremidades dos fios desencapados platina-irídio torcida precisa estar conectado para conduzir fios usado para conectar o eletrodo estimulando a um isolador de estímulo. Isto é feito através de solda as extremidades livres do fio de platina-irídio para ~ 50 cm 30 fios bitola. Primeiro, fita o fio de platina-irídio torcida para uma bancada de trabalho e queda de uma poça de HCl concentrado sobre uma extremidade livre do fio torcido. Em seguida, retirar cerca de 1 cm de isolamento de cada fio usando um cortador de arame. Coloque a extremidade descascada de um fio condutor adjacente à ponta do fio torcido e aplicar calor de um ferro de ponta fina, depois de solda até que os dois fios são bem encaixada. Deslizar um pequeno comprimento de tubulação de calor encolher sobre a ligação do fio exposto e reduzi-lo se encaixam com o calor. Repita o procedimento para o segundo fio. Fogo polonês a ponta de uma pipeta Pasteur 15 centímetros e orientar o fio de platina-irídio torcido para baixo a pipeta até cerca de 6 cm da torcida se projeta para fora. Usar um repelente de água epóxi (por exemplo, JB Weld) para selar as duas extremidades do eletrodo. Por último, coloque fichas banana para as extremidades do cabo para conexão com o isolador de estímulo. Sob observação estereoscópica, coloque a ponta do eletrodo em PBS e procure por bolhas produzido eletroliticamente vindo apenas o fim do corte das pontas dos eletrodos. Se as bolhas vêm do lados dos fios torcidos, corte o eletrodo com um corte transversal utilizando uma lâmina de barbear fresco única vantagem para restabelecer isolamento intacta aos eixos longo fio. Ao solucionar problemas para resolver efeitos de estímulo aberrante, tente fazer uma ponta do eletrodo recém-cortado. Pratos de gravação consiste em comoinserir piolhos cultura em uma placa de cultura que fica 35 milímetros em duas varas de 1,0 x 12 milímetros de vidro espaçadas cerca de 1,0 cm. Anexar bastões de vidro à base de prato por aquecimento dos tubos de vidro e, em seguida, pressionando-os para a base com uma pinça. Para condições de gravação estático, adicione 1,5 mL de meio para o prato. Em seguida, mergulhe um pedaço cm ~ 10 mm de largura e 3-4 longa de algodão estéril em 1,0 mL de meio. Dobre o algodão pela metade ao longo do eixo e colocá-lo ao longo do interior bem na inserção com uma pinça estéril. O algodão molhado ajuda a manter a umidade prato. Três compressível 4 mm de comprimentos de tubulação são igualmente espaçados em torno da inserção. Cubra o prato firmemente com filme de policloreto de vinilo, que permite a troca gasosa. Cortar em torno de sua parede meados de vertical com uma única lâmina fio da navalha para remover o excesso de cloreto de polivinila filme. Configuração eletrofisiológicas Uma fatia de montagem insira a cultura é colocada na câmara de gravação IPDM administrados para gravações eletrofisiológicas. O conjunto de prato insert / cultura na câmara IPDM administrados é coberto por um disco de plástico 2 mm de espessura fornecido com a câmara de IPDM administrados, com vários pequenos orifícios posicionados conforme necessário para gravações de eletrodos, médio entrada / saída de tubos, etc Nós monitorar periodicamente pH do meio com um eletrodo em miniatura combinação de pH e temperatura com um termopar tipo T miniatura sonda montada em um microeletrodo semi-selado para garantir pH 7,3 e 36,0 ° C condições. A câmara de inserção / é arejada com 5% de carbono do ar de dióxido de equilíbrio e médio seja realizada estática ou em um fluxo (1,2 mL / minuto) de configuração com o centro inserir realizada em 35-36 ° C. Para condições de fluxo, média é aquecido com um aquecedor inline, novamente para manter o centro da câmara de gravação a 36 ° C. Um sistema de bomba peristáltica com um alívio de pressão traz em meio às culturas fatia sem pulsações da bomba. Um aspirador fornecido com a câmara de IPDM administrados é usado para remover meio da inserção através de sucção suave. Para a estabilidade, a câmara é montada em um palco especialmente projetado microscópio Burleigh-Gibraltar invertida que mantém um microscópio invertido e se senta em uma mesa de vibração livre. Pequenos furos são abertos através do envoltório de inserção de policloreto de vinilo, com uma pequena ferramenta de cautério, operado por bateria. Em seguida, se uma configuração de fluxo é para ser usado, o fluxo de entrada e saída é iniciada, seguida da colocação de um eletrodo terra. Caso contrário, basta colocar o eletrodo terra no local. Eletrodos, realizada no local com micromanipuladores, estão posicionados logo acima uma fatia visualizados com um microscópio invertido com ampliação de 5x (Fig. 1). Começar com o eletrodo de registro seguido pelo eletrodo de estimulação. Nós usamos um monitor de áudio notar quando o microeletrodo faz contato com a fatia. A ponta é posicionada no ponto médio ao longo da camada piramidal CA3 célula do corpo. As gravações são iniciados, e em seguida o eletrodo estimulante é gentilmente tocou a superfície ponto médio do giro denteado. Em ambos os casos, os movimentos do eletrodo iniciais são realizados com controles grosseiro, e posicionamento final apenas com o hidráulico, controla muito bem com uma iluminação de contraste de fase, para que as camadas de células do corpo podem ser facilmente distinguidas. Eletrodos avançar em incrementos de 25 mM ~ sob visualização microscópica direta. Uma vez eletrodos toque do tecido, o avanço dos eletrodos outra 20-30 mM. As gravações são iniciados antes o eletrodo estimulando seja posto em prática para ter certeza isso não vai acionar SD (ie, através de um estímulo mecânico). ~ 10 minutos estão autorizados a passar antes que sejam iniciados experimentos. Transynaptically induzida SD. Otimizar evocado CA3 potenciais de campo da seguinte maneira (Fig. 2). CA3 potencial de campo são evocados com 100 pulsos mS (0,2 Hz) começando com uma corrente que é suficiente para desencadear uma resposta (por exemplo, ~ 1-5 mA). Mova o eletrodo de registro em incrementos ao longo do eixo neurônio piramidal tempo até que o potencial de campo é máxima. Então, aumentar a corrente com o eletrodo de registro nesta posição e observe a resposta máxima de corrente (por exemplo, ~ 1-20 mA). Finalmente, use meia-máxima intensidade do estímulo para experiências (por exemplo, sham controle de estimulação periódica). Determinar o limiar para SD sinapticamente evocado (Fig. 2). Com os eletrodos configurados como descrito acima para potenciais evocados de campo, mude o paradigma de estimulação para único, rajadas manualmente evocadode 10 pulsos (10 Hz @ 100 mS / pulso), um paradigma anteriormente aplicado em estudos com animais todo. Aumentar progressivamente a intensidade da corrente por estouro de estímulo até que SD é acionado. Espere pelo menos 60-120 seg entre os estímulos. Relatório limiar SD em coulombs (ie, tempo x corrente). Em outros experimentos que requerem medição de respostas à indução de SDs múltiplas, use uma força de estímulo provável que evocam SD (por exemplo, ~ 100-500 nC). Desencadear SD min cada 9 por uma hora. Tenha certeza de usar técnicas assépticas durante experimentos. Após a última SD, volte a inserir a cultura às condições de incubação normal. Marca o prato cultura notar a cultura que experimentou SD. Nosso hábito é colocar uma marca única para a esquerda e duas marcas à direita da inserção da cultura fatia, observando cada um dos três culturas como # 1, # 2 e # 3 da esquerda para a direita. Mudança média a cada 3-4 dias até a colheita da cultura. Para SD recorrentes, siga os procedimentos descritos acima. Normalmente, teste para uma mudança no limiar SD 1, 3, 7 e 14 dias depois de uma hora inicial de SDs múltiplas. CA3 área de rápido e lento potencial de possíveis mudanças são registradas através de diversos sistemas de processamento digital de sinal. 2. Imagem Vital exemplar em culturas Slice Hippocampal Comportamento funcional dinâmico do residente células do sistema imunológico (ou seja, microglia) podem igualmente ser monitorizadas em culturas fatia sem lesão celular ou ativação imune (Fig. 3) 9. Por exemplo, para rotular microglia para avaliar o seu movimento associado a alterações da atividade sináptica SD, usamos fluoróforo-tagged isolectin-IB 4. "PBS Lectin" é PBS com cátions adicionais (0,1 mM cada CaCl 2, MgCl 2, MnCl 2) desde cátions divalentes (0,1-1,0 mM) são necessárias para ligar a lectina α-D-galactosyl metades nas membranas celulares microglial. Faça uma solução de "PBS Lectin": Para 1 L PBS, usando técnica asséptica e filtração estéril, acrescentar: 100 L de MgCl 2 1M 100 L de 1M MnCl 2 100 L de CaCl 2 1M Misturar bem para combinar e manter refrigerado a 4 ° C. Apenas 500 mL de "PBS lectina" é necessária por frasco de isolectin, mas uma vez que pode ser refrigerado e mantido por meses em um momento, ele pode ser útil para fazer backup de volumes maiores. Reconstituir AlexaFluor 594-tagged isolectin-IB4 (isolectin) liofilizada em pó para 1 mg / mL em "PBS lectina". A fim de minimizar fotobranqueamento, execute esta etapa o mais rápido possível, minimizando a exposição à luz. Isolectin pode ser aliquotado a 20 mL uma vez reconstituído em 1mg/ml e mantido a -20 ° C por até um ano. Diluir isolectin a 20 mcg / mL em meio de crescimento e culturas fatia incubar a condições de incubação normal de 40-10 horas antes de imagem. Imagem set-up. Set-up de imagens consiste em: microscópio, obturador da câmera, luz, filtro de densidade neutra 2,0, 36 ° C, o gás: 5% de CO2, o ar (ou 20% de oxigênio, nitrogênio equilíbrio). Ligue o microscópio, câmera, luz UV, controle de temperatura e gases, pelo menos, uma hora antes da imagem. Configurar Metamorph Imagem protocolo. Do "Journal" drop-down menu, escolha "Run Jornal …". Este deve pedir a abertura da pasta de jornais, a partir do qual você deve selecionar "Motion w-var afs (revista previamente estabelecido que segue os passos abaixo)", clique em "Abrir". A "Autofocus Frequency" janela pop-up que vem, manter em Número 1, clique em "OK". Em seguida, o Setup "Sequential Arquivo Na …" janela pop-up, manter tudo como está: Nome Base: Imagem; Número de imagens: 1; Largura número: 3; Salvar como tipo: Metamorph TIFF; se a imagem já existe -> Substituir automaticamente; Clique em "Selecionar diretório …", isso fará com que o" Procurar pasta "janela de pop-up. Aqui, selecione a pasta (ou criar uma nova pasta), onde os quadros filme deve ser salvo. Então, quando a pasta correta (por exemplo C: \ Data \ Folder Nova) é exibido na parte inferior do "Setup Sequential Arquivo Na …" janela, clique em "OK". Na janela Acquire: Selecione a configuração no canto inferior esquerdo para ser DiIMGBIN2; "O tempo de exposição": 20ms; "Binning": 1. Em seguida, na guia especial: "Modo Sensor": FT; "Digitizer ": 10MHz (Ganho EM); "Gain": Gain3 (3x); Selecione "Ganho EM: 45"; obturador da câmera: Aberto para Expose; modo claro: EXP PRE clara; Conde Clear: 2, Trigger Mode e Modo de disparo Live: Normal (TIMED). "Frames Para médio": 3. Clique em "Fechar". Depois de configurar a imagem Metamorph, coloque a inserção em um prato de cultura de 35mm com duas hastes de 1 milímetro de vidro na parte inferior. Coloque três milímetros 2 pedaços de tubos de borracha montado entre as paredes da inserção e da placa de cultura para estabilizar ainda mais a inserção. Coloque um pedaço ~ 10 mm de largura de algodão embebido em um meio adicional de 1 mL dentro da inserção para manter um ambiente umidificado. Certifique-se que ela fique alinhada com as paredes e longe das fatias do hipocampo. Cobrir a parte superior da placa de cultura firmemente com filme de cloreto de polivinila para evitar a perda de líquidos. Certifique-se que o foco da imagem é a camada de células CA3 piramidal. Nota de orientação da fatia por tirar fotos em fase de 5x, 10x e 20x. No "Find Focus" janela que aparece na tela, Faixa de conjunto, a corrente + / – para ser "8", e Precisão, em micron (s), a "1" (ambas as caixas na parte inferior deve ser verificado) . Clique em "Find Focus" para garantir uma imagem em foco. No "Adquirir Timelapse" janela, selecione o intervalo de tempo a ser "um minuto" e Duração de ser "6 horas" (estes são os nossos parâmetros de aquisição preferencial). Para capturar com precisão os movimentos da microglia, imagem não deve ser menos freqüente do que uma vez por minuto. No armazenamento de imagem, selecione Stack. A atualização caixa Janela de imagem devem ser verificadas, mas não as outras duas caixas de baixo. Selecione "Illum" ser "Lambda". Clique em "OK". O filme começará a ser executado. Isto significa que nada mais pode ser realizada dentro do programa Metamorph até a conclusão do filme ou até que você parar o filme no início clicando Esc, depois que o filme irá então parar na etapa cronometrada próxima aquisição. No final do filme, verifique se há lesão celular por triagem Sytox como descrito acima (A). 3. Extração de RNA de baixo nível de citocinas Sinalização 15/11 Nós apresentado anteriormente instruções detalhadas para a detecção de baixos níveis de citocinas em culturas de sinalização fatia usando qPCR e técnicas de PCR de matriz 6,7. Temos marcadamente melhorou a sensibilidade das nossas abordagens para a detecção de citocinas em culturas de mRNA fatia e apresentar essas melhorias aqui. As melhorias incluem a nossa abordagem para a colheita de tecidos e isolamento de RNA, prescreening de amostras para fator de necrose tumoral alfa (TNF-α) as mudanças e preamplfication cDNA, que são a 6 vezes mais sensível do que as técnicas anteriores e, por exemplo, permitir a detecção para o primeira vez da cultura fatia interferon-gama (IFN-λ) de detecção. 15 Preparação PCR. Colheita da cultura fatia. Experimentos seguintes, insere a cultura fatia estão submersos em 2-3 mL de RNA mais tarde e armazenadas a 4 ° C por até três dias até ulterior processamento. Para colher, retire estranhas (ou seja, todos os tecidos adjacentes ao hipocampo propriamente dito) de tecido usando uma faca de diamante e levante as fatias individuais em RNase / DNase livre tubos de 1,5 mL de centrífuga contendo 0,5 mL de fosfato estéril salina tamponada (PBS), usando uma tinta de ponta fina escova. Amostras de rotação (10.000 rpm x 1 min) de uma forma estereotipada para que todos os slices aderir para o mesmo lado de seus tubos. Remover PBS sobrenadante e ressuspender amostra em 500 mL TRIzol. Armazene as amostras à temperatura de -80 ° C ou manter em gelo até a extração de RNA. A extração de RNA usingTRIzol com o kit Micro RNeasy resultados em maior rendimento de RNA (Fig. 4) que o uso do kit sozinho. Descongelar TRIzol-amostras e incubar em temperatura ambiente por 5 min. Dissociar do tecido, desenho amostras cima e para baixo com 1 mL ponta pippetor e / ou vortex até que o tecido sólido não é mais visível. Adicionar 100 mL de RNase free (RF) clorofórmio e inverter tubo 2-3 vezes para misturar. Incubar 3 minutos à temperatura ambiente, vórtice cada min. Centrifugar a 13.000 rpm por 15 min a 4 ° C. Transfira o sobrenadante para um tubo de microcentrífuga de 1,5 mL. Tenha cuidado para não perturbar a interface. Adicionar um volume igual de temperatura ambiente de 70% de etanol RF grau de biologia molecular (~ mL 300). Misture delicadamente por pipetagem cima e para baixo algumas vezes. Continue com os seguintes passos conforme as instruções kit RNeasy Micro: Aplicar a amostra a uma coluna RNeasy micro colocado em um collectio 2mLtubo n. Centrifugar a 10.000 rpm por 15 seg, descarte por escoamento. Lavar coluna RNeasy com 350 mL de buffer RW1. Centrifugar a 10.000 rpm por 15 seg, descarte por escoamento. Adicionar 10 uL DNase solução estoque 1-70 RDD mL tampão, misture delicadamente. Aplicar 80 mL de solução de DNase diretamente membrana e incubar em temperatura ambiente por 20 min. Lavar coluna RNeasy com 350 mL de buffer RW1. Centrifugar a 10.000 rpm por 15 seg, descarte de fluxo e tubo. Adicionar 500 mL tampão RPE para a coluna RNeasy. Centrifugar a 10.000 rpm por 15 seg, descarte por escoamento. Adicionar 500 mL de etanol 80% RF grau de biologia molecular para a coluna RNeasy. Centrifugar a 10.000 rpm por 2 min, descarte de fluxo e tubo. Lugar coluna RNeasy em novos tubos com as tampas abertas. Centrifugar à velocidade máxima (ou seja, 14.000 rpm) por 5 min. Transferência coluna RNeasy a um tubo de microcentrífuga de RF. Aplicar 14 mL de água RF diretamente à membrana. Centrifugar a 10.000 rpm por 1 min para eluição. Armazene as amostras à temperatura de -80 ° C ou continuar os próximos passos. Quantificação do RNA. Diluir 1:200 em RiboGreen RF 1x Tris-EDTA (TE) buffer. Prepare tRNA fermento para ser usado como o padrão de RNA. Ações de trabalho é armazenado em -20 ° C a 100 mcg / mL Diluir para 1 mg / mL (10 mL em 990 mL TE). Criação de normas da seguinte forma: Para 100 ng / mL, adicionar 100 mL, por 80 ng / mL, adicionar 80 mL e 20 tRNA TE mL, por 60 ng / mL, adicionar 60 mL tRNA e 40 mL TE, para 40 ng / mL adicionar 40 mL tRNA e 60 mL TE, para 20 ng / mL, adicionar 20 mL e 80 tRNA TE mL, e para 0 ng / mL adicionar 100 mL de TE. Preparação de amostras: Combine 99 mL TE + 1 mL de amostra. Executar cada amostra em duplicata. Usando um pipetador multicanal, adicione 100 mL de RiboGreen diluído por poço. Pipeta cima e para baixo para misturar. Medida de fluorescência em um leitor de placas. Fluoresceína programa (485 nm/535 nm, 0,1 seg). Exportar os resultados em uma planilha Excel. Determinar a concentração de RNA. Gráfico de absorção versus concentração de RNA e criar um melhor ajuste da linha de regressão linear no Excel. Determinar concentrações das amostras de RNA a partir da equação de regressão associado com a linha de melhor ajuste. Determinar a qualidade do RNA. Integridade banda ribossomal RNA é medido através de gel de agarose (Fig. 4). Embora seja impraticável para executar uma fração de cada amostra de RNA obtidas (uma vez que = 1 mg de RNA é necessária e os nossos rendimentos são pequenos), é uma boa idéia para executar periodicamente um gel de agarose desnaturante em uma amostra exemplar como prova de que o método , quando feito corretamente, a produção de alta qualidade RNA (ou seja, sem degradação). Prepare um gel de agarose 1% (para um volume de 100 mL). Limpe o tanque de eletroforese, lançando bandeja e gel pentes cuidadosamente com RNase AWAY. Pesar 1 g de agarose ultrapura para um balão. Adicionar 83 mL de água livre de RNase e 10 mL de MOPS 10x [3 – (N-Morfolino) propanesulfonic ácido] buffer e microondas até agarose é dissolvido ea solução é clara (~ 3 min). Para fazer tampão MOPS 10x Combine 83,7 MOPS g, 13,6 g de acetato de sódio e 3,7 g EDTA. Adicione 800 ml de água livre de RNase, misture para dissolver. Ajustar o pH a 7.0 e preencher a 1 L. Filtro de esterilizar ou autoclave. Conservar à temperatura ambiente, protegido da luz. Permitir que o gel para esfriar a 55 ° C e adicionar 7 mL de formaldeído 37% (este passo deve ser feito em uma Cobertura de vapores químicos). Despeje em gel de fundição bandeja e permitir que o gel solidificar no capô. Preparar as amostras de RNA. RNA tampão de amostra (500 mL, fazer doce). Combine 50 mL MOPS 10x, 250 formamida mL, 90 mL de formaldeído 37%, 108 mL RF H ​​2 O e 2 mL de brometo de etídio (solução a 10 mg / mL). Para mcg 1-10 de RNA, adicione duas vezes o seu volume usando tampão de amostra, para uma diluição de três vezes. Desnaturar a 95 ° C por 5 min, e depois relaxar no gelo por 5 min. Spin-briefly e carregar o total da amostra em poços ao lado de uma escada de RNA (adicionar corante de carregamento, se desejar). Electroforese Encher a câmara com 1x tampão MOPS. Electroforese em 50-75 volts até que os marcadores tenham migrado cerca de 2/3rd comprimento do gel. Visualize o gel em um transiluminador UV. Verifique se existem 18S 28S afiada e RNA ribossômico (rRNA) bandas, e que a banda 28S é duas vezes mais intensa que a banda 18S (Fig. 4). RNA degradado terá uma aparência manchada, bandas fuzzy, ou não apresentam uma proporção de 2:1. Normalmente usamos densidade óptica para avaliar a qualidade do RNA total. Embora não seja tão sensível espectrofotometria, UV através de um Nanodrop é um meio rápido e eficiente de verificação da qualidade do RNA. Olhe para a densidade óptica (DO) 260/280 proporção de 1,5-2,0. Tenha em mente que a solução na qual o RNA é ressuspenso (tampão TE contra água) irá afetar a relação de OD. Atividades PCR. Pré-PCR configuração Design de primers específicos Usando Primerblast NCBI http://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/ : Digite o número do gene alvo adesão Refseq. PCR especificar o tamanho do produto de 70 a 200 pb. Especificar um Tm de 55-72 °, com diferença inferior a 5 ° entre primers para a frente e reverso. Selecione "Primer devem abranger uma junção exon-exon" para reduzir fundo genômica. Permitem verificar especificidade para Rat banco de dados RNA Refseq para garantir que primers não reconhecem metas adicionais. Escolha um par de iniciadores a partir dos resultados que se encaixa nos seguintes critérios: 18-30 bases de comprimento. Inferior a 2000 bases para além do seu modelo. 40-60% de conteúdo guanina-citosina para garantir a vinculação estável de primer para modelo. Escolha de um gene de referência. Não gene cada referência será adequado para o seu conjunto experimental. Cada vez que um novo paradigma é usado, a estabilidade de sua referência deve ser verificada. Para consistência, optou-se por utilizar um dos genes de referência de quatro fornecido no Profiler 2 RT conjunto PCR. Um gene boa referência deve obedecer aos seguintes critérios: Seu nível de expressão não é alterada pelo paradigma experimental. É expresso em níveis semelhantes ao do gene alvo. Para selecionar uma referência adequada: Revisão da literatura para identificar prováveis ​​candidatos para um gene de referência estável em seu sistema. Por exemplo, testamos Rpl13a porque mostrou-se estável em estudos de isquemia 11,12. Primers design como discutido acima (ou encontrar primers já validados para genes de referência comum em um banco de dados como RTPrimerDB http://www.rtprimerdb.org/ ). Otimizar primers juntamente com primers gene-alvo (veja abaixo). Determinar qual candidato é referência mais estável usando softwares como Normfinder (http://www.mdl.dk/publicationsnormfinder.htm), que calcula um valor de estabilidade para cada gene com base na variação intragrupo e seleciona o gene (s) com o mínimo de expressão variação ao longo das amostras. Por exemplo, Rpl13a é um gene de referência ideal para SD (Fig. 4). Otimizar primers. Para obter resultados consistentes e confiáveis ​​de qPCR, primers têm de cumprir determinados critérios de reprodutibilidade, sensibilidade, especificidade e. É melhor testar esses parâmetros para cada par de primer novo. Reprodutibilidade é testado pela execução técnica repetições. Sensibilidade pode ser avaliada pelo desempenho, com uma curva padrão de sucessivos quatro diluições. Especificidade é determinada pela confirmação de um único produto por análise da curva de derreter e eletroforese em gel (Fig. 5). Executar uma placa de qPCR para testar a qualidade do seu primers, ea concentração de primers a serem utilizados. Usando cDNA sintetizado a partir do cérebro todo RNA, criar uma curva padrão (série de quatro consecutivas diluições) como segue: 1, 1:4, 1:16, 1:64, 1:256, e sem controle de modelo (NTC) . Para cada diluição, 1 mL executar cDNA em duplicaçãote para cada concentração de primers, (ou seja, 100 nM, 200 nM, 300 nM). Confirmar que técnicos replica dar valores consistentes Ct. Examinar os valores Ct para a curva de diluição. Traçar os valores de Ct contra a concentração de cada uma das diluições. O gráfico resultante deve ser linear com um coeficiente de correlação de bom (ou seja,> 0,95). Examine derreter curva para confirmar a presença de um único produto de amplificação (ou seja, único pico). Se houver picos múltiplos, ou os picos não são semelhantes, isto pode sugerir contaminação, mispriming, artefato de primer dimer, etc (Fig. 5). Um pico no NTC, provavelmente, correspondem a dímeros de primers que formam mais facilmente na ausência de modelo de cDNA, e não deve ser uma preocupação. Confirmar derreter curva de dados através da resolução produtos amplificados em gel de agarose 1%. Prepare um gel de agarose 1% (para um volume de 100 mL) Pesar 1 g de agarose em um frasco. Adicione 100 ml de 1X Tris acetato-EDTA (TAE) e microondas até agarose é dissolvido ea solução é clara. 1 L 50x tampão TAE é composto por 2 M Tris base, 57 mL de ácido acético glacial e 0,05 M EDTA (pH 8,0). Diluir tampão TAE 1x com água destilada (concentração final: 40 mM Tris-acetato e 1,0 mM EDTA). Permitir que o gel para esfriar a 55 ° C antes de adicionar o brometo de etídio a uma concentração de 0,5 mg / mL. Despeje em gel de fundição bandeja e deixe-o solidificar à temperatura ambiente. Para executar, coloque o gel na câmara de eletroforese cheio de 1x TAE, combine 10 mL de amostra da placa qPCR com 2 mL de corante carregamento 6x, misture bem e coloque em poços ao lado de uma escada de peso molecular. Electroforese em 50-150 volts até os marcadores migraram uma distância apropriada, dependendo do tamanho esperado de seu produto cDNA. Visualize com um transiluminador UV. Confirmar que o produto amplificado PCR é de tamanho adequado para o seu alvo. Dímeros de primers será em torno de 50 pb. Pré-screen para TNF-α aumentou. TNF-α desde inicia reações inflamação na periferia, que suspeita que este também é verdadeiro para o cérebro e use triagem inicial para TNF-α mRNA como um marcador do estado de cultura fatia imunológico (ou seja, normal, sham e grupos experimentais) antes de prosseguir às análises gama completa PCR. Se normal e sham controlar os níveis de TNF-α mRNA não são dentro de um intervalo inter encontrado dentro de nosso laboratório, os experimentos (ou seja, normal, sham e grupos experimentais) são descartados e não proceder a análises gama completa PCR. iScript síntese de cDNA. Para cada amostra de RNA, combinar o seguinte em um tubo de PCR: 4 mL mistura de reacção de 5x, 1 mL da transcriptase reversa, 25 ng de RNA, e RF H ​​2 O para um volume final de 20 mL. Misture delicadamente por pipetagem e spin down brevemente. Incubar: 25 ° C, 5 min, 42 ° C, 30 min; 85 ° C, 5 min. Diluir 1:04 (adicionar 60 mL de água livre de RNase). Armazenar a -20 ° C ou se manter em gelo até estar pronta para uso dentro de horas. qPCR TNF-α para. Prepare uma mistura mestre para cada par de primer. Combine 12,5 mL iQ SYBR green, uma mistura de iniciadores mL e 10,5 mL de água por amostra. Tanto para o nosso Rpl13a e TNF-α primers, 200 nM é a concentração ideal. Ajustar a quantidade de primers e do volume de desperdício, se necessário em um tubo de microcentrífuga 1,5 mL RF e manter em gelo, enquanto você configurar a placa. Configurar uma placa de qPCR com controles / shams / experimentais. Use 1 mL de amostra por cDNA em duplicado para cada gene. Adicionar 24 mL de seu mix de mestre para cada poço e pipetar cima e para baixo para misturar. Tenha muito cuidado para evitar bolhas, como eles irão interferir com as leituras de fluorescência. Executar 40 ciclos de amplificação por PCR: 95 ° C, 8.5min; 40 ciclos: 95 ° C, 10 seg e 60 ° C, 30 seg; 72 ° C, 20 seg / ciclo. Melt curva: 55 ° C, 1 min, 80 ciclos de incrementos de 0,5 ° C por 10 segundos cada a partir de 55 ° C. Analisar os dados (ΔΔCt método;. Fig. 4) 13. síntese de cDNA por PCR arrays. Calcular o volume (mL) de cada amostra para ter 250 ng de RNA. Escolha uma quantidade de RNA (100 ng a 1 mg) que você pode extrair de forma consistente a partir de suas amostras. RT 2 Kit First Strand – conforme instruções do fabricante. Brevemente: Descongelar e spin down todos os reagentes. Para cada amostra de RNA, combinar o seguinte em um tubo de PCR: 250 ng de RNA, 2 mL do DNA genômico 5x (gDNA) buffer eliminação e água para um volume final de 10 mL. Misture delicadamente por pipetagem e spin down brevemente. Incubar a 42 ° C por 5 min. Frio no gelo por 1 min. Nesse meio tempo, preparar a transcrição reversa cocktail (RT) (amostra por): Combine 4 mL de tampão 5x RT 3, 1 mL de primer e mix de controle externo, 1 mL da enzima RT mix 3, e 3 l de água. Adicionar 10 mL de coquetel de RT para cada amostra e misture delicadamente. Incubar a 42 ° C por 15 min. Parar a reação pela incubação a 95 ° C por 5 min. Adicionar 91 mL de RF H ​​2 O a cada reação de síntese 20 mL de cDNA (diluir para um volume final de 111 mL). Misture bem por pipetagem. Armazenar a -20 ° C ou se manter em gelo até estar pronta para uso dentro de horas. RT 2 Profiler conjunto PCR. As instruções a seguir seguem os do fabricante e são reiteradas aqui por conveniência. Preparar reagentes Descongelar e spin down todos os reagentes. Prepare cocktail experimental: Combine 1350 mL de 2x SABiosciences RT 2 qPCR SYBR Green Master Mix, 102 mL de cDNA diluído e 1248 mL de RF H ​​2 O para um volume final de 2700 mL. Remova cuidadosamente conjunto PCR de saco selado. Dispense cocktail em um reservatório de carga. Adicionar 25 mL para cada poço com uma pipeta multi-canal. Cuidadosamente selo placa matriz PCR. Centrifugar a placa a 10.000 rpm por 1 min em temperatura ambiente. Colocar no gelo até programa de PCR está pronto. Execute o programa de ciclos apropriado para sua máquina. iCycler: 95 ° C, 10 min 40 ciclos: 95 ° C, 15 seg e 60 ° C, 1 min. Melt curva: 55 ° C, 1 min, 80 ciclos de incrementos de 0,5 ° C por 10 segundos cada a partir de 55 ° C Analisar os dados. Selecione "Auto de cálculo" para os ciclos de linha de base. Selecionar "User Defined" para a posição limite para definir manualmente o valor limiar. Em "View Log", defina limite na parte inferior de um terço da fase linear da trama de amplificação. Certifique-se de manter o mesmo valor limiar entre corridas. Exportação de dados. De entrada em um arquivo de Excel. Upload para SABiosciences PCR Análise de Dados Array. http://sabiosciences.com/pcrarraydataanalysis.php Selecione genes de referência – que usamos Rpl13a. Nossa prática é a seguinte: Confirmar os resultados com pelo menos variedade PCR uma duplicata. Mudanças de 3 vezes array não deve ser confirmada por amplificação específica posterior alvo PCR 6,7. Mudanças menos de 3 vezes deve ser confirmado por subseqüente amplificação específica alvo PCR ou o uso de arrays 03/02 PCR (para confirmar as alterações 2x. DNA pré-amplificação é usado para analisar as metas com o esperado expressão ultra-baixa (Fig. 6). RT SABiosciences 2 da Nano kit PREAMP síntese de cDNA e mistura cartilha destinam-se a uma pré-amplificação de RNA para permitir o uso de pequenas quantidades (100-100 ng) de RNA da amostra para executar uma ampla PCR completo. Cada mistura de iniciador permite a amplificação do gene 89 modelos específicos de cDNA-alvo com viés mínimo. Temos usado este sistema como um meio de amplificar sinais de baixo nível, tais como IFN-λ para um nível detectável. RT 2 Nano kit síntese PREAMP cDNA – conforme instruções do fabricante. Brevemente: Descongelar e spin down todos os reagentes. Para cada amostra de RNA, combinar o seguinte em um tubo de PCR. 1-100ng de RNA, 2 mL do tampão 5x gDNA eliminação e água para um volume final de 10 mL. Misture delicadamente por pipetagem e spin down brevemente. Incubar a 42 ° C por 5 min. Frio no gelo por 1 min. </li> Nesse meio tempo, preparar o cocktail RT (por amostra). Combine 4 mL de tampão 5x RT 3, 1 mL de primer e mix de controle externo, uma mistura de síntese de cDNA mL de enzima, um inibidor da RNase mL e 3 mL de água. Adicionar 10 mL de coquetel de RT para cada amostra e misture delicadamente. Incubar a 42 ° C por 15 min. Parar a reação pela incubação a 95 ° C por 5 min. Armazenar a -20 ° C ou manter em gelo até estar pronto para uso. amplificação de cDNA com primers específicos. Misture o seguinte em um tubo de PCR: 12,5 mL PCR Master Mix, 7,5 mL primers específicos, e 5 mL de cDNA diluído. Executar 12 ciclos de amplificação PCR. 95 ° C, 10 min. 12 ciclos: 95 ° C, 15 seg e 60 ° C, 2 min. Segure a 4 ° C. Adicione 2 mL redutor de reação lado para cada amostra. Incubar a 37 ° C por 15 min. Parar a reação pela incubação a 95 ° C por 5 min. Adicionar 84 mL de água RF para cada reação de amplificação 27 mL de cDNA. Armazenar a -20 ° C ou se manter em gelo até estar pronta para uso dentro de horas. Amplificar genes alvos individuais usando SAB primers e SYBR green master mix, como descrito acima. 4. Multiplexados Ensaios Fosfoproteína de sinalização de citocinas Ensaios fosfoproteína Mutliplexed são usados ​​para definir citocina ligante-receptor a jusante de sinalização (Fig. 7). Determinar a quantidade de proteína total nas culturas fatia. Culturas colheita fatia suavemente levantar corta de inserções e coloque em 1 mL frio (4 ° C) PBS. Centrifugar os tubos por 30 segundos e PBS remover. Colocar em gelo seco até terminar a colheita. Armazenar a -80 ° C. Homogeneizar culturas fatia para ensaio de proteína total. Prepare tampão de lise celular de acordo com instruções do fabricante. Adicionar inibidores da protease para um volume total de buffer necessário para colocar pelo menos 200 mL de tampão de lise de cada cultura fatia. Por exemplo: adicionar 20 mL do Fator 1, 10 mL do Fator 2, e 20 mL de 500 mM PMSF em DMSO a 4,95 mL tampão de lise celular. Descongelar culturas fatia em 200 mL tampão de lise no gelo. Sonicate culturas fatia cinco vezes em 1 seg pulsos e coloque imediatamente de volta no gelo. Amostras Vortex por 10 segundos. Centrifugar as amostras a 4 ° C por 15 min a 13.000 rpm. Transfira o sobrenadante para um tubo limpo e manter em gelo. Realizar ensaio de proteína total. Elaborar normas de proteína. Ações reconstituir albumina sérica bovina (BSA) de acordo com instruções do fabricante. Elaborar normas que vão 0-1000 mg / mL diluído em água de alta pureza para BCA ensaio de proteína. Calcular o volume de reagente necessário trabalhar com base no número de amostras e repetições. Por exemplo: (8 + 18 padrões de amostras desconhecidas) x (2 repetições por amostra) x (0,2 mL de reagente de trabalho necessário por poço) = 10,4 mL volume total necessário para todas as amostras carregadas no microplaca. Rodada até 12 mL volume total para assegurar o volume o suficiente. Quando a mistura reagente A com B, Reagentes para o reagente de trabalho, alguns turbidez pode ocorrer, mas devem desaparecer em breve. Carga de 10 L de amostras e padrões por poço. Load 0,2 mL de reagente de trabalho em poços. Cobrir a placa com fita adesiva e agitar por 30 segundos para misturar. Incubar placa a 37 ° C por 30 min. Placa arrefecer à temperatura ambiente (cerca de 10 min) antes de ler em um leitor de placas a 595 nm. Construir uma curva padrão usando o Microsoft Excel com absorbância medida contra a concentração que o esperado. Um bom coeficiente de correlação é igual ou superior a 0,98. Calcular as concentrações de proteínas em amostras usando a equação linear derivada da curva padrão. Diluir as amostras em tampão de lise para quantidades iguais de proteína e armazenar a -80 ° C até que esteja pronto para processamento posterior. Concentração de proteína deve variar 200-900 mg / mL de acordo com instruções do fabricante. Realizar ensaio multiplex. Nota: Os ensaios fosfoproteína multiplexados tomar 2 dias total para completar, com 1 hora de set-up inicial e carregamento de placa seguida de uma incu overnightpasso bation e incubação adicional e os passos de lavagem no dia seguinte. Mapear quais poços que conterá lisado de acordo com planilha no manual. Descongelar amostras de tecido homogeneizado e lisados ​​kit à temperatura ambiente e depois colocar no gelo. Trazer todos os tampões e reagentes fornecidos no kit à temperatura ambiente (exceto estreptavidina e miçangas). Prepare contas para o ensaio multiplex. Tubos contendo cobrir contas juntamente com folha de alumínio para proteger da luz. Tubos de vórtice durante 5 segundos e manter em gelo. Diluir 1:50 em contas junto tampão de lavagem. Cada poço deve conter 1 mL de contas acoplado em 49 mL de tampão de lavagem para um volume total de 50 mL por poço. Calibrar o aparelho de vácuo. Lave a placa com 100 mL de tampão de lavagem por poço. Ligue a vácuo e sucção de desconto em qualquer excesso de líquido dentro de 2-5 seg. Se a remoção completa de tampão demora mais ou menos do que 2-5 seg, ajuste válvula de pressão nesse sentido. Seque o fundo do prato completamente antes de adicionar amostras. Vortex as contas diluída acoplado por 5 segundos e adicionar 50 mL de poços designado. Imediatamente filtro a vácuo e seco no fundo do prato com uma toalha de papel. Lave a placa duas vezes com 100 mL de tampão de lavagem por poço. Seque o fundo do prato depois de cada lavagem. Vortex amostras descongeladas por 3 seg e adicionar 50 mL de poços designado. Lugar de vedação de fita sobre a placa e incubar por 15-18 horas agitando a 300 rpm à temperatura ambiente, protegido da luz. Líquidos em excesso e filtro a vácuo placa lavar três vezes com 100 mL de tampão de lavagem. Seque o fundo do prato depois de cada lavagem. Diluir 1:25 anticorpo de detecção em tampão de lavagem. Cada poço requer um anticorpo de detecção mL em um volume total de 25 mL tampão de lavagem. Coloque fita adesiva na placa e proteger da luz com papel alumínio. Agitar durante 30 segundos, aumentando gradualmente a velocidade até 1100 rpm. Continue agitando em 300 rpm por 30 min em temperatura ambiente. Filtro de vácuo a placa e lavar três vezes com 100 mL de tampão de lavagem. Seque o fundo do prato depois de cada lavagem. Ao mesmo tempo proteger a placa da luz, prepare uma diluição de 1:100 de estreptavidina-PE com volume suficiente para adicionar 50 mL por poço. Proteger a solução da luz. Vortex bem e adicionar 50 mL diluída estreptavidina-PE por poço. Incube com agitação a 1100 rpm por 30 segundos seguido por 10 min a 300 rpm. Vácuo tampão em excesso filtro desligado. Lave a placa três vezes com 100 mL de buffer ressuspensão por poço. Seque o fundo do prato bem após cada lavagem. Adicionar 125 mL de buffer ressuspensão a cada poço e agitar por 30 segundos a 1100 rpm. Imediatamente ler placa ou armazenar a 4 ° C ao abrigo da luz por até 24 horas. 5. Imitando e Modulação da sinalização de citocinas Proteínas recombinantes de citocinas (com transporte) são utilizados para imitar as mudanças de SD. Proteínas liofilizadas (por exemplo, TNF-α) são armazenados por até 1 ano a -20 ° C. Após diluição de uma solução estoque com 0,1% albumina sérica bovina, as alíquotas são preparados, armazenados a -20 ° C, até a sua utilização dentro de 3 meses. Quaisquer manipulações de culturas fatia são atualizados pelo menos um dia todos os terceiros. Sinalização de citocinas é silenciado por: Uso de citocinas tradicional cascata de sinalização agentes farmacológicos; Uso de antagonista do ligante solúvel [por exemplo, receptor TNF solúvel 1 (como descrito acima para ligantes recombinante)], ou Silenciamento de genes [ie, pequeno RNA de interferência (siRNA)]. Entrega de siRNA para as células neuronais é muitas vezes problemática. Comum lipídica baseado reagentes geralmente resultam em eficiência de transfecção de baixa e perda de viabilidade celular. Em vez disso, usamos siRNAs Thermo Scientific Dharmacon Accell, que permitem a knockdown alta eficiência sem o uso de um reagente de transfecção. Aqui nós mostramos knockdown de ciclofilina B, uma proteína não-essenciais expressa em todos os tipos de células, como a confirmação do uso deste método em culturas fatia. Protocolo de entrega foi adaptado para a cultura de lâminas de instruções do fabricante para uso em células aderentes. Diluir tampão siRNA 5x a 1x com RNase água livre. Prepare uma solução siRNA 100μM em 1x tampão Ciclofilina siRNA B é fornecido em 5 nmol. Ressuspender em 50 mL de tampão 1x para um estoque mM 100. SiRNA misturar com Accell entrega medium para uma concentração final de siRNA 1 Hm. Adicionar 11 mL de 100 M siRNA ações para 1100 mL de Accell meio da entrega de uma placa de 6 poços. Lugar na incubadora e permitir que a temperatura atingir a condições de incubação normais durante pelo menos 20 min. Usando um capuz BSL-2 e técnica estéril, insere transferência para a mistura contendo entrega poços. Incube com mix de entrega de 96 horas para knockdown proteína. Avaliar knockdown proteínas por Western Blot ou intensificada imunocoloração. Western blot, enquanto uma escolha primeiro potencial para a eficiência knockdown, pode ser muito insensível para baixo nível de sinalização imunes associadas com o fenômeno não prejudicial do SD. Assim, temos seguido negativo medições Western blot com a prata maior imunomarcação diaminobenzidina (DAB) e medições baseadas em computador densitometria (veja abaixo). 6. Confirmações proteômica Especificidade celular de mudanças fosfoproteína é estabelecida usando imunocoloração 6,7. Fix culturas fatia para 24 hrs com fixador PLP consiste em: 10 mL de paraformaldeído a 16%, 1,096 g de lisina, 0,42 g de fosfato de sódio, e 0,17 g periodato de sódio, cheio até um volume total de 80 mL com água ultrapura (fixador é de 6,2 pH). Após 24 horas, remova culturas fatia da pastilhas com um pincel fino e transferência para PBS contendo azida de sódio (100 mg / L) até que esteja pronto para a seção. Então, incubar fatias, pelo menos, 24 horas em PBS-20% de sacarose, corte culturas fatia inteira para 20 seções mM, e para montar slides gel revestida. Imunomarcação fluorescente (por exemplo, para NFκB) é realizado da seguinte forma com todos os passos acoplado a agitação em ~ 50 rpm. Lavar culturas fatia em 3 mL PBS três vezes por 10 min. Colocar as lâminas montadas com 20 mM fatia culturas em frascos Coplin com ~ 40 mL PBS para todas as etapas de lavagem. Lavar culturas fatia em PBS três vezes, 10 min por lavagem. Coloque algumas gotas de SFX sinal enhancer em culturas fatia e incubar em câmara úmida por 30 min. Incubar as culturas fatia para 2 horas a 37 ° C com anticorpo anti-coelho NFκβ em 1:100 diluídos em 0,75% Triton X-100 em PBS. Adição da solução de anticorpo diretamente fatias. Retire as fatias da solução de anticorpos e lavar três vezes em PBS por 10 minutos por lavagem. Incubar fatias em temperatura ambiente por uma hora em cabra anti-coelho AlexaFluor 594 anticorpos em 1:50 em 0,75% Triton X-100 em PBS. Centrífuga AlexaFluor anticorpo 594 por 15 min a 10.000 rpm para remover qualquer precipitado que podem ter se formado em solução. Lavar três vezes em PBS, 10 min por lavagem. Dip slides em água destilada para enxaguar os sais de PBS. Lamela com Prolongar médio Antifade e deixe secar por pelo menos duas horas, coberto ao abrigo da luz. Visualize com os tradicionais ou confocal microscopia (Fig. 7) de fluorescência. Mudanças de produção de proteína knockdown siRNA pode ser avaliada pela sensibilidade melhorar DAB tradicionais imunocoloração 7 via intensificação de prata 16 e quantificação densitométrica subsequentes (por exemplo, conforme mostrado aqui para ciclofilina B) (Video Figura 2). Imunomarcação para ciclofilina B segue os procedimentos padrão para imagens de campo claro, recentemente detalhados, 7 usando: Anti-camundongo ciclofilina B (1:100) por 24 horas a 4 ° C; Seguido por horseradish peroxidase rotulagem anticorpo secundário (1:100); E visualização DAB. f DAB as reações são muito fracos para permitir quantification17 densitométrico digital, eles podem ser intensificados com um procedimento de prata diferenciadas de acordo com Quinn e Graybiel 16. Reidratar slides e depois lave x 3 para 10 minutos em água de alta pureza. Colocar as lâminas em água de alta pureza em uma jarra Coplin e quente a 56 ° C. Prepare uma solução de nitrato de prata amoniacal (0,5%): Cloreto de estoque de amônio (25-30%) é recém-diluído (1:1) com água de alta pureza. Adicionar hidróxido de amônio (~ 500-600 mL por 100 mL) gota a gota, com agitação da solução 0,5% de nitrato de prata que irá brevemente ficar turva e desmarque. Aquecer a solução a 56 ° C. Incubar por 10-12 min seções. Lavagem das lâminas por 15 segundos em água de alta pureza (este e todos os passos subseqüentes são feitos em temperatura ambiente usando frascos Coplin). Dip slides por 15 segundos em tiossulfato de sódio a 1% (penta). Dip slides por 15 segundos em água de alta pureza. O tom slides por 2 min em solução de cloreto de ouro de 0,2%. Mergulhar as lâminas em água de alta pureza para 15 seg. Expor os slides para 0,5% de ácido oxálico por 2 min. Mergulhar as lâminas por 15 segundos em água de alta pureza. Tratar os slides por 5 min em tiossulfato de sódio 5%. Lavagem das lâminas completamente em alta desidratar a pureza da água, e lamela. Slides estão agora prontos para a quantificação densitométrica 17. Todos os equipamentos, incluindo a iluminação de campo claro, é ligado por pelo menos 20 min antes de imagem. Seções cultura inteira fatia são gravadas em 5-10x em um microscópio invertido. Intensidade da luz é definida como um nível uniforme (por exemplo, ~ 2,6 V) e não mudou em toda a aquisições de imagem. Filtros de densidade neutra são usados ​​como necessárias para reduzir imagem completa transmitida intensidade de luz para ~ 1500 em uma escala de 12-bit (0-4095), onde "0" é completamente preto e 4095 é completamente branca. Imagens digitais são então adquiridos e armazenados eletronicamente para todos (ou seja, sham e controle de amostras experimentais), incluindo uma imagem de fundo derivado formar uma área do slide sem seções cultura fatia. A imagem de fundo é subtraída de todas as imagens (sham e experimental) e uma área de interesse (AOI) desenhada em torno de cada cultura fatia e intensidade da luz transmitida registrados. Faixa de intensidade da imagem é ajustado para uma faixa constante para todos os experimentos. Para maior clareza, resultante expressa como uma densidade relativa em relação aos níveis de controle (Fig. 8). 7. Resultados representativos: Figura 1. Cultura fatia eletrofisiológicas gravação paradigma microeletrodo de gravação. É o primeiro colocado na camada de neurônios piramidais CA3 e, em seguida, um eletrodo bipolar estimulante é colocado no giro denteado (DG). Figura 2. CA3 potenciais evocados de campo e sinapticamente induzida depressão alastrante. (A) Experimentos começar com determinação da corrente necessária para maximizar o padrão de respostas CA3 área do campo potencial e, em seguida, uma meia-máxima intensidade é usado para provocar CA3 área de potenciais evocados de campo. Esta documentos a normalidade da respostas evocadas sináptica entre as preparações. Se uma fatia de campo potenciais pós-excitatória sinápticas não são pelo menos 3 mV, fatias são descartados. (B) limite, seguida trans-sinapticamente evocado para desencadear a depressão alastrante é determinado (direita, respostas lentas), enquanto na potenciais de campo mesmo tempo (à esquerda , respostas rápidas) são usadas para documentar que as preparações são saudáveis ​​o suficiente para seguir 10 Hz estímulo (por exemplo, amplitudes dos desvios verticais em rápida registros potencial são semelhantes). Figura 3. Movimento microglia associada com redução Evidence atividade. Synaptic mostra que ramos microglial estender e retrair com a atividade sináptica aumenta, mas de longa distância movimento destas células em resposta à atividade sináptica não tem sido descrita no cérebro ileso. Nossos resultados usando fluorescentes rotulagem isolectin B4 da microglia mostram que uma fração dessas células percorrer longas distâncias em condições normais. Além disso, o número destes microglia de viajar é significativamente aumentada quando a atividade sináptica é abolida pela exposição da cultura à tetrodotoxina, como mostrado na imagem que o acompanha. Caminhos linhas vermelhas marca percorrida pelo microglia durante um período de 6 horas com setas azuis marcando a origem de um microglia poucos exemplares. Calibração bar, 50 mm. Figura 4. Atividades de triagem PCR. (A) Usamos TRIzol juntamente com Qiagen kits para o isolamento de RNA, pois, em nossas mãos, isso resulta em significativamente maior (P <0,001; t-test). Rendimento RNA a partir de culturas fatia do hipocampo do que o uso de kits de Qiagen sozinho (B) Em Além disso, periodicamente confirmar que os nossos procedimentos de extração de RNA produzir RNA de alta qualidade intacta, conforme determinado por meio de um gel que mostra bandas nítidas RNA. (C) Nós usamos software NormFinder escolher um gene de referência com um valor melhor estabilidade. Por exemplo, as culturas expostas fatiapara lipopolyssacharide (100 ng / mL por 2 horas) foram analisados ​​por três genes de referência (Rpl13a, β-actina, 18s). Valores Ct são usados ​​para calcular um valor de estabilidade. Nossos dados aqui [e que para outros experimentos usando a depressão alastrante (dados não mostrados)] mostram que Rpl13a é um gene de referência ideal. (D) Nós usamos o método "ΔΔCt" como um meio sensível e reprodutível para detectar diferenças mudança vezes RNA entre os grupos experimentais e controles sham. Figura 5. Verifica reação de PCR. (A) Medimos amplificações curva de diluição de primers como um meio de verificar a qualidade das reações de PCR. Por exemplo, amplificações ótima mostram um aumento de (1-5) uniforme dos limiares Ct. (B) Em contrapartida, amplificações não são uniformes com primers pobres (1-5). (C) Além disso, realizamos uma curva de derreter na conclusão dos testes de PCR para confirmar que o desejado amplicons são detectados (ie, uma curva de pico único), que indica a ausência de DNA dupla fita incluindo dímeros de primers, contaminando DNA e misannealed produto da PCR (que aparecem como curvas de pico múltiplo). Figura 6. Nano pré-amplificação permite a detecção de IFN-λ em culturas fatia do hipocampo. Uma vez que apenas ~ 50 células T são encontrados em uma cultura fatia (de ~ 55,000-90,000 células total), foi utilizada a RT 2 nano Kit Síntese PREAMP cDNA como um meio para detectar a expressão nível potencial ultra-baixos de IFN-λ. Este meio de pré-amplificação de cDNA proporcionou um aumento de 12 vezes na sensibilidade à RNA níveis. Os resultados apresentados acima ilustram a capacidade de pré-amplificação para aumentar a sensibilidade de detecção. Ct limite para referência gene Rpl13a foi de 20,5 com amplificação inicial e este foi aumentado para 14,1 com o uso do kit pré-amplificação, um aumento de 12 vezes correspondente a 12 ciclos de amplificação por PCR de cDNA. Em paralelo, IFN-λ não foi detectável (0,0), mas estava bem dentro do alcance de detecção (29,0), com pré-amplificação. Figura 7. Inata de citocinas via de fosforilação mudanças fosfoproteína. (A) pré-tratamento efeito Exemplar de TNF-α (ie, neuroproteção) em inata fosforilação fosfoproteína citocina percurso de 24 horas após a lesão excitotoxic em culturas fatia do hipocampo. Os resultados mostram mudanças CA1 área entre as fatias pré-tratadas por 3 dias com 100 ng / mL TNF-α antes da exposição ao N-metil-d-aspartato (NMDA) em comparação com aqueles expostos ao NMDA por si só (ou seja, experimental vs sham) expressa como uma percentuais. Observe que o TNF-α induziu um aumento sustentado na fosforilação JNK e ATF-2, bem como um aumento transitório no NFκB. (B) A distribuição espacial da NFκB ativação (ou seja, presença de NFκB fosforilado no núcleo) é revelado por imunocoloração ( vermelho). YoYo verde núcleos manchas em uma seção de cultura fatia [por exemplo, em astrócitos (cabeça da seta)]. Neurônios piramidais, que de outra forma também aparecem em verde, amarelo, porque são, em vez de marcação concomitante com fosforilada NFκB (vermelho). Calibração bar, 25 mm. Figura 8. . Confirmação proteômica de eficiência siRNA intensificação prata Diferenciadas de diaminobenzidina peroxidase-imunocoloração base para ciclofilina B mostra que siRNA pode significativamente (P <0,001; ANOVA-Holm-Sidak método) reduzir a fatia global de hipocampo ciclofilina expressão B 3 dias após a aplicação de 200, 500 , ou 1.000 siRNA nM.