Methode voor het nieuwe anti-kanker medicijn ontwikkeling met behulp van Tumor Explantaten van Chirurgische Specimens

1. Voorbereiding van de media De media werd bereid met 10% FBS (16140-071 – GIBCO) in DMEM/F-12 (1X), Liquid 01:01 (10565-042 – Invitrogen) met 0,6% Agar gezuiverd, Gegranuleerde (1.01614.1000-EMD ). Steriele omstandigheden werden gehandhaafd gedurende het experiment. Voor de bereiding van media 5 ml van de FBS (16.140-071 – GIBCO) werd toegevoegd aan 45 ml van DMEM/F-12 (1X), Liquid 01:01 (10565-042 – Invitrogen), waardoor uiteindelijk volume van 50 ml. De bereide media werd bewaard in een waterbad bij 37 ° C temperatuur. De agar-oplossing werd bereid met behulp van warmte magnetron methode. 0,3 gram kristalsuiker agar werd opgelost in 50 ml gedestilleerd water met behulp van een magnetron. De agar-oplossing werd afgekoeld tot 37 ° C temperatuur door hem in het water bad. We gebruikten gelijk volume van de media uit stap 1.2 en 1.3 en voorbereid stamoplossing. De verhouding van 0,6% agar (0,5 ml) en 10% FBS-D-MEM/F-12 media (0,5 ml) was 1:1, waardoor het totale volume van 1 ml in elke well van 6 well platen. 2. Tissue verwerking Glioblastoma multiforme (GBM) weefsels werden ontvangen direct na de operatie van de afdeling Pathologie. Het weefsel werd geclassificeerd als GBM van de afdeling Pathologie. Het weefsel werd overgebracht naar patri-plate met behulp van pincet voorzichtig en gewassen met ijskoude 5 ml 1XPBS voor 3 keer. Seriële secties van de specimens werden gesneden uit de ontleed monsters van de tumor blokken (ongeveer 10 mm in diameter) met een chirurgisch mes (Feather-2976 # 10) en pincet (Fisher Scientific) te creëren. Blokken werden overgebracht naar een 6 wells plaat. Elk putje werd met 1 ml van de media te vermelden in stap 1.4. Het weefsel had genoeg blootstelling aan de lucht te houden weefsel levensvatbaar te maken. Tumor blokken werden vervolgens geïnjecteerd met ofwel DMSO (5%) of TMZ (2,5 nM) en geïncubeerd gedurende 16 uur bij 37 ° C in bevochtigde lucht met 5% CO2. 0,1 ml van DMSO (5%) of TMZ werd geïnjecteerd drie keer in de tumor blokken op verschillende plaatsen voor consistente behandeling. Het medicijn werd geïnjecteerd met behulp van insuline spuit 1 ml 0.37X12.7mm 28G1 / 2 (Comfort point-26027). Na 16 uur blokken werden gewassen met 5 ml 1XPBS voor 3 keer. Na het wassen de blokken werden met 10 ml 10% v / v formaline gedurende 24 uur (Ricca chemisch bedrijf) in 50 ml buizen (Basix-5539802) en verwerkt voor paraffine ingebedde 4μm secties. De formaline vaste gedeelte werd geplaatst in bekerglas op de roer plaat met "NO HEAT" en verwerkt door middel van de volgende oplossingen voor 30 minuten in elke oplossing. 30% ethanol, 50% ethanol, 75% ethanol, 80% ethanol, 95% ethanol, 100% ethanol, en Xyleen. Het weefsel werd uitgewist op keukenpapier en geplaatst in gesmolten paraffine (58 tot 60 ° C, Fisher Paraplast paraffine) gedurende 30 minuten. Het weefsel werd ingebed in mallen met behulp van Surgipath Blue Ribbon paraffine, was ingebed weefsel gekoeld tot kamertemperatuur. Paraffine ingebedde 4μm weefselcoupes werden genomen en op Fisher Plus dia's. 3. Immunohistochemie Immunohistochemie werd uitgevoerd zoals eerder beschreven 1. Deparaffinization en rehydratatie Plaats de objectglaasjes in een rack en voer volgende stappen uit. Xyleen voor de 3×5 minuten (3 keer voor 5 minuten), 100% ethanol voor de 3×5 minuten, 95% ethanol voor de 1×5 minuten, 70% ethanol voor de 1×5 minuten, spoel onder stromend leidingwater gedurende 3 minuten. Antigen herstel met warmte geïnduceerd herstel van de epitoop Dompel dia's in 1X citraatbuffer (Thermo-wetenschappelijke AP9003-500) opgelost in gedestilleerd water in een bekerglas. Kook gedurende 15 minuten op een hete plaat (zorg ervoor dat delen don "t vallen van de dia). Koel de oplossing gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur. Spoel de dia's met 1X PBS voor de 3×5 minuten. Remming van de interne peroxide Dompel de dia's in methanol (Fisher Scientific-A-452-4) met 0,3% waterstofperoxide (Fisher Scientific-BP2633-500-opgelost in gedestilleerd water) in een bekerglas gedurende 15 minuten. Spoel in 1X PBS voor de 3×5 minuten. Het blokkeren van Bedek de weefsels met 10% normaal geit serum. Overdracht van de dia's in een vochtige doos en incubeer 1 uur bij kamertemperatuur. Was de dia's met 1X PBS voor de 3×5 minuten. Primair antilichaam Secties werden gedurende de nacht geïncubeerd bij 4 ° C met een primair antilichaam op volgende concentraties: de menselijke specifieke caspase-3 (1:1000, R & O-systemen, AF835), Ki67 (1:1, Dako, 15.626), verdund met 1X PBS. Spoel de dia's in 1X PBS 3×10 minuten op de volgende dag. Secundair antilichaam reactie Bedek de weefsels met 2-3 druppels van de HRP gelabeld secundair antilichaam (Envision systemen). Zet dia's in een vochtige doos en incubeer 1 uur bij kamertemperatuur. Was met 1X PBS voor 3×10 minuten. Detectie te ontwikkelen voor de chromogeen DAB kit (Vector laboratoria-SK-4100) voor de detectie van primaire antistof volgende protocol van de fabrikant. Counter vlekken Dompel de dia's met hematoxyline (10-15 s econden, zorg ervoor dat don "t overrun DAB-signaal). Afspoelen met leidingwater gedurende 3 minuten. Uitdroging Dompel de dia's in volgorde, 70% ethanol gedurende 5 minuten, 95% ethanol gedurende 5 minuten, 100% ethanol voor de 3×5 minuten, Xyleen voor 3×5 minuten. Dekglas de dia's met Permount montage reagens (Fisher Scientific-SP-15-100). Beelden werden gemaakt met behulp van Olympus fluorescentiemicroscoop (DP-72) .3.11). In alle experimenten werd specifieke etiketteringsvoorschriften bevestigd door de negatieve controle zonder primaire antilichaam. 4. Representatieve resultaten: We verzamelden chirurgische exemplaren van glioblastoma multiforme (GBM). De patiënten ondergingen de eerste operatie zonder voorafgaande chemotherapieën waaronder temozolomide (TMZ). De T1-gewogen beeld van de MRI met gadolinium verbetering in de figuur-1a toonde een verhoogde tumor in de rechter frontale kwab voor de operatie. De postoperatieve afbeelding (figuur-1b) bevestigde subtotaal verwijdering van de laesie na de operatie. De chirurgische weefsels werden gestuurd naar de afdeling Pathologie van de klinische diagnose doel, en de resterende exemplaren werden verwerkt tot de weefselverkrijging kader van de goedgekeurde Institutional Review Board (IRB) protocol aan de Ohio State University Medical Center. Hematoxyline en eosine (H & E) kleuring toonde de aanwezigheid van necrose, pseudopallisading cellen, en microvasculaire proliferatie (figuur 1-c). Zo werden deze tumoren histopathologisch gediagnosticeerd als GBM. Van de nota, tumor explantaten na incubatie zonder TMZ tot 48 uur handhaafde de cytoarchitecture van GBM. In tegenstelling met incubatie gedurende 72 uur of langer, hebben we de toename van het aantal van de gecondenseerde kernen in de exemplaren gemerkt, suggereert een deel van de tumorcellen begint te ondergaan apoptose. Als gevolg hiervan tumor weefsel na langere incubatietijd die fragmentarisch regio's die tumorcellen, die bij voorkeur werden waargenomen op en rond de necrotische gebieden (gegevens niet getoond) verloren gaat. Om te onderzoeken of deze tumor explantatie monsters betrouwbaar kan worden gebruikt voor het doel van de werkzaamheid van het geneesmiddel test, testten we het effect van TMZ behandeling. Figuur 2 geeft de stroom van de experimenten in deze studie. Een recente studie toonde aan dat intratumorale injectie van TMZ krachtiger effect op de groei controle van kwaadaardig glioom is dan dat van de systemische toediening van dit medicijn 2. Na incubatie gedurende 16 uur, werden deze explantaten ingebed met paraffine en seriële secties werden voorbereid voor kleuring. Immunohistochemie van de TMZ-behandelde GBM weefsels toonde een substantiële reductie van de Ki-67-positieve tumorcellen in vergelijking met de controle monsters. Op zijn beurt heeft immunohistochemie met een apoptose marker, caspase-3, geen significante verschillen tussen de TMZ-behandelde glioom exemplaren en de controle monsters (figuur-3). Effect van de behandeling met TMZ werd verder gekenmerkt door het combineren van deze explantatie test samen met ofwel in vitro cultuur of flowcytometrie. In het bijzonder, zochten we naar het effect op stamcel-achtige tumorcellen (SCLTC) te bepalen. Daarom, na intratumorale behandeling met TMZ, voerden we bol vormen assay en flow cytometrie van deze tumor explantaten. De TMZ-behandelde monsters werden gescheiden in individuele enkele cellen en deze enkele cellen werden uitgezaaid in een lage dichtheid (een cel per microliter of lager) in 96-well platen in serum-vrij medium aangevuld met bFGF en EGF. In de controlegroep, was de vorming van de tumor sferen van de tumor explantaten waargenomen na 7 dagen incubatie. Gezien het feit dat bol formatie is een eigenschap van SCLTC 3 4, wijzigingen in het aantal tumor bollen door een medicamenteuze behandeling geeft het effect op de SCLTC. Evenzo werd flowcytometrie van de gedissocieerde tumor explantaten met een celoppervlak marker, CD133, uitgevoerd om het effect te controleren op de SCLTC. Als SCLTC in heterogene tumorcellen in GBM worden selectief uitgeroeid door een behandeling met geneesmiddelen, zou men kunnen voorspellen dat flow cytometrie moet afname van de CD133-positieve fractie te detecteren door de behandeling (gegevens niet getoond). Figure.1 magnetische resonantie beelden (MRI) van een patiënt GBM. Representatieve cijfers van de inspectie voor het figuur-1a en na de operatie figuur-1b. Figuur-1c is H & E kleuring van verse GBM weefselmonster. Originele vergroting, 40X. Figuur. 2 De experimentele stroom van blok cultuur experiment. Figuur-2a. Afbeelding van verse chirurgische GBM ontvangen van de afdeling pathologie. Figuur-2b toont Dissectie van tumor blok in 10 mm kleine stukjes met de hulp chirurgisch mes. Figuur-2c is de drug (TMZ) behandeling van tumor blokken met behulp van insuline spuit. e 3 "/> Figuur. 3 Immunohistochemie. Immunohistochemie van GBM weefsel blokken geïnjecteerd met DMSO of TMZ met geactiveerde caspase-3 en Ki67. Hematoxyline werd gebruikt voor nucleaire kleuring. Originele vergroting, 40X.