Detectie van neuritische plaques in de ziekte van Alzheimer Mouse Model
Summary
Een van de pathologische kenmerken van AD is de vorming van amyloïde eiwit β positief neuritische plaques. In dit protocol beschrijven we twee methoden om seniele plaques op te sporen in transgene muizen die model AD: immunohistochemische detectie met behulp van de ABC-en DAB-methode en fluorescerende detectie met behulp van thioflavin S kleuringsmethode.
Abstract
De ziekte van Alzheimer (AD) is de meest voorkomende neurodegeneratieve aandoening die leidt tot dementie. Neuritische de vorming van tandplak is een van de pathologische kenmerken van de ziekte van Alzheimer. De centrale component van neuritische plaques is een kleine draadvormige eiwit amyloid β-eiwit (Aß) 1, die is afgeleid van een sequentiële proteolytische splitsing van het beta-amyloid precursor proteïne (APP) door β-secretase en γ-secretase. De hypothese houdt in dat amyloïde plaques als de onderliggende giftig mechanisme in AD pathologie 2 Aγ bevatten. De post-mortem analyse van de aanwezigheid van plaque neuritische bevestigt de diagnose van AD. Om verdere onze kennis van Aγ neurobiologie in AD pathogenese, werden verschillende muizenstammen uitdrukken AD-gerelateerde mutaties in het menselijk APP genen gegenereerd. Afhankelijk van de ernst van de ziekte, zullen deze muizen ontwikkelen neuritische plaques op verschillende leeftijden. Deze muizen fungeren als handige tools voor het bestuderen van de pathogenese en de ontwikkeling van geneesmiddelen die de APP verwerking route en neuritische plaquevorming zou kunnen beïnvloeden. In dit protocol, we hanteren een immunohistochemische methode voor specifieke detectie van neuritische plaques in AD model muizen. We zullen specifiek ingaan op de voorbereiding van de extractie van de half hersenen, paraformaldehyde fixatie, cryosectioning, en twee methoden om de neurotische plaques op te sporen in AD transgene muizen: immunohistochemische detectie met behulp van de ABC-en DAB-methode en fluorescerende detectie met behulp van thiofalvin S kleuringsmethode.
Protocol
Discussion
Immunohistochemie met behulp van de gebiotinyleerde gelabeld antilichaam 4G8 vlekken seniele plaques in AD gemodelleerd muizen met specificiteit. De kleuring uitkomst kunnen kwantificeren en vergelijken van plaque belasting tussen de verschillende behandelingsgroepen. Er zijn een aantal cruciale stappen die het resultaat kunnen beïnvloeden. Omdat de hemi hersenen zijn niet vóór doorbloed de extractie van de schedel moet erop worden gebruikt tijdens de extractie proces om schade te voorkomen aan de Hemi hersenen. Aangezien de hemi hersenen is passief doorbloed, raden wij incuberen in 4% PFA gedurende ten minste 48 uur bij 4 ° C vóór het onderdompelen in de 30% sucrose oplossing. Als alternatief zou transcardial perfusie voordat zij worden op het verkrijgen van de hersenen. Als de hersenen correct is bevestigd, moet het een rubberachtige textuur. In het geval dat de hersenen niet goed is bevestigd, zal de secties gemakkelijk scheur in de D'Olomos oplossing of tijdens de kleuringen.
De 4G8 monoklonaal antilichaam is reactief naar aminozuur residuen 17-24 van Aß en herkende de epitoop in de kernsequentie (VFFAE). Omdat 4G8 is afgeleid van muizensoorten, heeft het de neiging om een hogere achtergrondkleuring. Zo hebben we ervoor gekozen om de secties in de aangegeven verdunning incubeer met overwegingen om tot een echt signaal terwijl het minimaliseren van achtergrondkleuring.
In aanvulling op immunokleuring voor neuritische plaques opsporen met behulp van de 4G8 antilichaam, is een thioflavin S kleuringsmethode ook gebruikt om plaques te identificeren. Thioflavin S is een homogeen mengsel kleurstof die het gevolg is van methylatie van dehydrothiotoluidine met sulfonzuur. Thioflavin S niet-selectief bindt bèta-sheet inhoud van eiwitten, zoals die in amyloid oligomeren. Na binding, thioflavin ondergaat een karakteristieke blauwe verschuiving van de emissie-spectrum. Omgekeerd thioflavin S binding aan de monomere formulieren worden niet ontlokken een blauwe shift en kon niet worden gedetecteerd met fluorescerende microscoop. Thioflavin S vlekken biedt een snel alternatief voor het screenen op amyloid als de intensiteit van de fluorescentie maakt een goede visualisatie van kleine hoeveelheden amyloïde afzettingen. Echter, een nadeel over vlekken thioflavin S is het gebrek aan specificiteit. Veel andere weefsels componenten, waaronder met uitgebreide bèta-sheets, zoals fibrinoids, hyaline, keratine, etc, hebben een nogal affiniteit voor deze kleurstof.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk werd ondersteund door de Canadese Institutes of Health Research (CIHR), de familie Townsend, en Jack Brown en familie de ziekte van Alzheimer Research Foundation (naar WAS). WS is de houder van de Canada Research Chair bij de ziekte van Alzheimer. PTTL wordt ondersteund door de Natural Sciences and Engineering Research Counsel en de Michael Smith Foundation for Health Research Scholarship.
Materials
| Name of the reagent and equipment | Company | Catalogue number |
|---|---|---|
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148-1KG |
| Polyvinylpyrrolidene | Sigma-Aldrich | PVP40-100G |
| Sucrose | Fisher Scientific | S5-3 |
| Ethylene glycol | Sigma-Aldrich | 324558-2L |
| Tissue-Tek O.C.T. Compound | Sakura | 4583 |
| 88% formic acid | Fisher Scientific | A118P-500 |
| Triton X-100 | ICN Biomedicals | 807426 |
| H2O2 | Sigma-Aldrich | H-1009 |
| Biotin Labeled 4G8 Antibody | Cedarlane | SIG-39240-500 |
| Elite ABC kit | Vector | PK-6100 |
| Imm PACT DAB | Vector | SK-4105 |
| Xylene | Fisher Scientific | X4-4 |
| Entellan | EM science | 65037-71 |
| Superfrost* Plus Microscope Slides | Fisher Scientific | 12-550-15 |
| Cryostat | Leica | CM-3050-S |
| MX35 Premier microtome blade | Thermo Scientific | 3052835 |
| Thioflavin S | Sigma-Aldrich | T1892-25G |
References
- Glenner, G. G., Wong, C. W. Alzheimer’s disease: initial report of the purification and characterization of a novel cerebrovascular amyloid protein. Biochem Biophys Res Commun. 120, 885-890 (1984).
- Hardy, J., Selkoe, D. J. The amyloid hypothesis of Alzheimer’s disease: progress and problems on the road to therapeutics. Science. 297, 353-356 (2002).
- Qing, H., He, G., Ly, P. T., Fox, C. J., Staufenbiel, M., Cai, F., Zhang, Z., Wei, S., Sun, X., Chen, C. H., Zhou, W., Wang, K., Song, W. Valproic acid inhibits Abeta production, neuritic plaque formation, and behavioral deficits in Alzheimer’s disease mouse models. J Exp Med. 205, 2781-2789 (2008).
- Sun, X., He, G., Qing, H., Zhou, W., Dobie, F., Cai, F., Staufenbiel, M., Huang, L. E., Song, W. Hypoxia facilitates Alzheimer’s disease pathogenesis by up-regulating BACE1 gene expression. Proc Natl Acad Sci U S A. 103, 18727-18732 (2006).
